第五章 生长繁殖

第五章微生物的生长繁殖与生存因子基本要求：了解微生物生长繁殖的概念及研究微生物生长的方法、细菌生长曲线在污（废）水微生物处理的应用、掌握微生物生长量的测定方法；弄清微生物的生存因子以及其他不利环境因子对微生物的影响；微生物与微生物之间的关系；以及菌种的复壮与保藏方法。重点：1、细菌各生长阶段的特点以及细菌生长曲线在污、废水微生物处理中的应用；2、微生物生长量的测定方法；3、微生物的生存因子以及紫外辐射对微生物的影响；4、微生物与微生物之间的关系；5、菌种的常用保藏方法。生物个体物质有规律地、不可逆增加，导致个体体积扩大的生物学过程。生长：生物个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。繁殖：生长是一个逐步发生的量变过程，繁殖是一个产生新的生命个体的质变过程。在高等生物里这两个过程可以明显分开，但在低等特别是在单细胞的生物里，由于细胞小，这两个过程是紧密联系又很难划分的过程。第一节微生物的生长繁殖一个微生物细胞合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用个体的生长原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，引起个体数目的增加。群体内各个个体的进一步生长群体的生长一、细菌的群体生长繁殖微生物的特点：个体微小肉眼看到或接触到的微生物是成千上万个单个的微生物组成的群体。微生物接种是群体接种，接种后的生长是微生物群体繁殖生长。对细菌群体生长规律的了解是对其进行研究与利用的基础1、生长曲线生长曲线(GrowthCurve)：细菌接种到定量的液体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横座标，以菌数为纵座标作图，得到的一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。在微生物学中提到的“生长”，均指群体生长。细菌的生长曲线一般用菌数的对数为纵坐标作图一条典型的生长曲线至少可以分为停滞期，对数期，静止期和衰亡期等四个生长时期细菌数量生长曲线生长速率稳定期衰老期细菌数目的对数值0时间t细菌的数量很大，都是10的n次方，取对数作图时方便，0~10代表1～1010总菌数活菌数停滞期对数期0+_活细菌重量变化曲线曲线：群体重量W(mg/l)——时间t细菌内源呼吸增长率上升阶段及细菌大量死亡阶段mg/L活细菌重量t0时间曲线t`点切线斜率值=?t`重量增长速率t`增长率下降阶段生长情况用活细菌生长曲线来描述①增长速率上升阶段•为什么培养初期细菌群体重量增长速率随时间不断增大？•A.营养物丰富，细菌增殖；B.细菌在细胞内以糖原、油滴等形式储存营养物，细菌个体重量增大增长率上升阶段mg/mL0时间t活细胞重量②增长速率下降阶段•为什么增长速率较前下降了？增长率下降阶段mg/mL0时间t活细胞重量营养物浓度（好氧细菌还包括氧气）下降这些限制性因素还不是十分严重，细菌的代谢速度变慢，没有停止代谢产物积累对细菌的某些酶产生抑制③内源呼吸及死亡阶段•———内源呼吸+毒物浓度更高•（个体）瘦→死•（群体）死亡率大于出生率•从曲线上反映为活细菌重量的进一步持续下降。•此时细菌的出生率是否为零呢？为什么？•不是，利用死亡细菌的残体营养各种生物具有类似的规律实验室通常采用细菌的数量变化绘制生长曲线。停滞期(Lagphase)：将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。也称延缓期、适应期。停滞期的特点：分裂迟缓、代谢活跃细胞形态变大或增长，例如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞的平均长度比刚接种时长6倍。一般来说处于迟缓期的细菌细胞体积最大细胞内RNA，尤其是rRNA含量增高，合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。对外界不良条件反应敏感。细胞处于活跃生长中，只是分裂迟缓在此阶段后期，少数细胞开始分裂，曲线略有上升。缓慢期－“万事开头难”•特征：细菌缓数慢目期的对数值0时间t提问：为什么会出现迟缓期呢？代谢活跃，个体体积、重量增高，不立即进行细胞分裂、增殖，数量不变甚至减少适应环境（合成相应的酶），营养储备（用于复制合成）•提问：根据上述原因选择接种何种状态的细菌迟缓期会较长？•对数期的细菌、稳定期或衰亡期、受损细胞、富集培养基的细菌•后三种稳定期细胞基本耗尽了各种辅酶或其他细胞成分受损细胞养伤修复富集培养基细菌需要合成“自力更生”酶菌种本身的遗传特性（如转基因高效菌）和接种数量也会影响迟缓期的长短。在实际工作中如接种菌种以启动新的水处理设施，投加新鲜污泥时，接种的细菌不习惯于新环境，会出现或长或短的迟缓期，迟缓期的出现会增加操作时间，降低工作效率采用处于高效菌群对数期的菌种、增大接种量、尽量保持接种前后所处的培养介质和条件一致等方法来缩短或消除迟缓期提问：我们可以通过哪些手段缩短迟缓期呢？对数生长期(Logphase)：又称指数生长期(Exponentialphase)以最大的速率生长和分裂，细菌数量呈对数增加，细菌内各成分按比例有规律地增加，表现为平衡生长。对数生长期的细菌个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，代谢旺盛、生长迅速、代时稳定，所以是研究微生物基本代谢的良好材料。它也常在生产上用作种子，使微生物发酵的迟缓期缩短，提高经济效益。对数期（青年）•所有细菌均繁殖K——比例常数KXdtdXKtXX0ln故称对数期。（相当于重量法细菌曲线的增长率上升阶段）细菌数目X增长率倍率的对数与时间成正比。特点•平均代时（繁殖一代的时间）最短•提问：细菌的代时与哪些因素有关？细菌数目的对对数数期值0时间t如大肠杆菌在20℃时其代时是35℃条件下的2倍；伤寒杆菌在含0.125％的蛋白胨培养基中的代时为800min，而在含1.0％时仅为40min。繁殖速度最快种类遗传、个体健康情况(营养、环境条件)•提问：哪个时期（迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期）代时最具有种属代表性？为什么？•最短值→无限长（休眠）•对数期代时——最短值•细菌代时通常指最适条件下的对数期代时•此时所有细菌在二分裂生长,分别测定t0时刻与t时间细菌的数量X0与X对数期细菌代时G计算1→2→22→23((22)×2)→24→25……2nt0t00lg3.32lg/lgXXXXnX=X0*2nX/X0=2nX0→……X0·24→……X(X0·2n)(n=1、2、3…)n—繁殖代数nttG0代时静止生长期(Stationaryphase)：由于营养物质消耗，代谢产物积累和pH等环境变化，逐步不适宜于细菌生长，导致生长速率降低直至零(即细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数)。稳定生长期又称恒定期或最高生长期，此时培养液中活细菌数最高并维持稳定。稳定期（中年）•出生率＝死亡率细菌缓数慢目期的对稳定期对数衰老期数期值0t时间•死亡原因—•营养短缺、代谢毒物增多•（相当于重量变化曲线中的增长率下降阶段）衰亡期(Decline或Deathphase)：营养物质耗尽和有毒代谢产物的大量积累，细菌死亡速率超过新生速率，整个群体呈现出负增长。该时期死亡的细菌以对数方式增加，但在衰亡期的后期，由于部分细菌产生抗性也会使细菌死亡的速率降低，仍有部分活菌存在。死亡期（老年）•死亡率＞出生率（相当于重量法的内源呼吸阶段）•提问：如何给细菌延年益寿呢？•补营养、环保（去除环境毒物）人类群体有类似规律吗？如果把地球看作是封闭的间歇式培养基，人类看作是细菌，人口若不加控制，必将经历由于资源枯竭，污染物遍地而引发的大灭绝。自救——节约、节育防止“营养物消耗过快”，环保防止“有害代谢物毒性抑制”。2、同步培养同步培养(Synchronousculture)：使群体中的细胞处于比较一致的，生长发育均处于同一阶段上，即大多数细胞能同时进行生长或分裂的培养方法。以同步培养方法使群体细胞能处于同一生长阶段，并同时进行分裂的生长。同步生长：通过同步培养方法获得的细胞被称为同步细胞或同步培养物硝酸纤维素滤膜法是最经典的获得同步生长的方法由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持2-3个世代，随后又逐渐转变为随机生长。3、连续培养将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获。分批培养（batchculture）or封闭培养（closedculture）培养基一次加入，不予补充，不再更换。连续培养(Continousculture）在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法。培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物是实现微生物连续培养的基本原则。连续培养•一方面连续进料，另一方面又连续出料。•原理：进料=补足营养(“污染物”)•出料=稀释菌浓度、毒物浓度•它又分为两种：恒浊连续培养、恒化连续培养。（1）恒浊连续培养测定所培养微生物的光密度值自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速使培养物维持在某一恒定浊度当培养室中的浊度超过预期数值时，流速加快，使浊度降低；当培养室中的浊度低于预期数值时，流速减慢，使浊度升高；恒浊培养器的工作精度是由光电控制系统的灵敏度来决定的如果所用培养基中有过量的必需营养物，就可以使菌体维持最高的生长速率。•恒浊——培养基浊度恒定（实质是细菌数量恒定）新鲜培养基光电池光源流速控制阀出水很少应用反馈控制（二）恒化连续培养使培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率下进行生长繁殖。（2）恒化连续培养•化——？新鲜培养基流速控制阀出水应用：环境工程、生物工程、实验室研究（细菌生理特性研究、细菌的快速筛选等）。流速恒定进料营养物总量•目前,污水连续生物处理法均（除SBR法）类似于恒化连续培养；（流速不完全恒定）4．污(废)水连续处理中的细菌生长状态•不同的生物反应器，细菌的生长状态可能不同！乃至同一反应器内不同位置处细菌生长曲线在污水微生物处理中的应用连续生物处理中的细菌状态表细菌的生长阶段应用举例特点迟缓期无连续化稳定操作中没有这一阶段对数生长期高负荷活性污泥法(大部分区域)稳定期生物膜法常规活性污泥法(大部分区域)生长繁殖快，代谢活力强，能大量去除废水中有机物。（缺点是细菌表面的粘液层和荚膜尚未形成，运动很活跃，不易自行凝聚成菌胶团，沉淀性能差，致使出水水质有机物浓度相对较高）衰老期低浓度污水延时曝气法污泥的厌氧消化营养物浓度过低，难以满足其他阶段细菌的生长需要虽然比对数生长期的差，但仍有相当的代谢活力，细菌体内积累了大量贮存物，如异染粒、聚β—羟基丁酸等，体表的粘液层和荚膜强化了细菌的生物吸附能力，自我絮凝、聚合能力强，在二沉池中泥水分离效果好，出水水质好。1:0.4~0.8BOD.d-细菌与降解BOD重量比1:0.4以下进水对数期稳定期衰老期平推流式活性污泥法占优势•细菌生长必然维持在一个与水质环境相适应的阶段；•提问：同一种方式中的细菌生长状态是否一成不变呢？•随水质波动而波动•毒害物波动(“冲击”)•营养波动(“失衡”)•提问：改善废水生物处理系统中效果的关键是什么？•防止“冲击”、找出并改善限制因子“失衡”是绝对的！总有限制性营养物控制生长。(———按营养配比，相对贫乏的营养物)四、微生物生长的测定单位时间里微生物数量或生物量（Biomass）的变化微生物生长：微生物生长的测定：个体计数群体重量测定群体生理指标测定评价培养条件、营养物质等对微生物生长的影响；评价不同的抗菌物质对微生物产生抑制(或杀死)作用的效果；客观地反映微生物生长的规律；•借助显微镜观察测定优点：快速，常用方法（一）测定总细菌数缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；1.涂片染色法0．01ml菌液均匀涂布，染色面积1cm2计数每个视野细菌的平均数量细菌数量=视野中的菌液体积=××个/mL目镜中的视野每个视野的面积由目测微尺的单元格量出，视野中菌液的体积按比例折算1视野菌液(ml)＝(0.01ml／1cm2)*视野面积(cm2)2.计数器(