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第八章氨基酸发酵•氨基酸制备最早是在1820年用蛋白质酸水解开始的，1850年化学合成氨基酸研究成功，1956年发酵生产谷氨酸。•氨基酸是重要营养物质，具有重要的生理功能，近年来随着氨基酸工业的发展，氨基酸在食品、医药、农业、化妆品等领域得到广泛应用，因此氨基酸的生产具有重要的意义。•食品工业中，甘氨酸、丙氨酸具有甜味，天冬氨酸、谷氨酸具有酸味，谷氨酸钠、天冬氨酸钠具有鲜味，赖氨酸、蛋氨酸等是人体必需氨基酸。•医药工业中，多种复合氨基酸制剂可通过输液治疗营养或代谢失调；精氨酸药物用于治疗由氨中毒造成的肝昏迷；丝氨酸药物用作疲劳恢复剂；蛋氨酸、胱氨酸用于治疗脂肪肝；L-谷氨酸与L-谷氨酰胺用于治疗脑出血后的记忆力障碍等。•化妆品生产中，胱氨酸用于护发素，丝氨酸用于面霜中；谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸与脂肪酸形成的表面活性剂，具有清洗、抗菌等功能，用于护肤品、洗发剂中。•在农业中，苯丙氨酸和丙氨酸可用于治疗苹果疮痂病；甘氨酸可制成除草剂。赖氨酸、蛋氨酸添加在饲料中，能加速家畜、家禽的生长，改善肉的质量。从20世纪初期，氨基酸实现工业化生产以来，氨基酸生产大体有蛋内质水解法、化学合成法、微生物发酵法和酶法四种生产方法。蛋白质水解法：早期味精生产、复合氨基酸；化学合成法：DL-蛋氨酸、甘氨酸、DL-丙氨酸；酶法：L-丙氨酸、L-色氨酸、L-丝氨酸；微生物发解法：生产60%以上的氨基酸，包括直接发酵法和添加前体发酵法。前三种方法成本高，工艺复杂，难以达到工业化生产目的。8.1谷氨酸的发酵生产•谷氨酸发酵规模、产量最大。•谷氨酸除用于制造味精外，还可以用来治疗神经衰弱以及配制营养注射剂等。•我国是世界最大味精生产大国。3．谷氨酸发酵机制及工艺控制•（1）谷氨酸生物合成途径：葡萄糖经糖酵解(EMP途径)和己糖磷酸支路(HMP途径)生成丙酮酸，再氧化成乙酰CoA，然后进入三羧酸循环，生成α-酮戊二酸，α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有NH4+存在的条件下，生成谷氨酸。原料：糖和尿素，通气条件TCA循环-酮戊二酸谷氨酸谷氨酸脱氢酶COOHCOOHC=O谷氨酸脱氢酶CHNH2CH2+NH4++NADPH2CH2+H2O+NADPCH2CH2COOHCOOH由葡萄糖生物合成谷氨酸的代谢途径(颜方贵)葡萄糖6-P-葡萄糖6-P-葡萄糖酸3-P-甘油醛5-P-核糖丙酮酸乙酰CoA草酰乙酸柠檬酸苹果酸异柠檬酸延胡索酸琥珀酸酮戊二酸谷氨酸透过细胞膜谷氨酸谷氨酸发酵的代谢途径•生成的丙酮酸，一部分在丙酮酸脱氢酶系的作用下氧化脱羧生成乙酰CoA，另一部分经CO2固定反应生成草酰乙酸或苹果酸，催化CO2固定反应的酶有丙酮酸羧化酶、苹果酸酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。•草酰乙酸与乙酰CoA在柠檬酸合成酶催化作用下，缩合成柠檬酸，进入三羧酸循环，柠檬酸在顺乌头酸酶的作用下生成异柠檬酸，异柠檬酸再在异柠檬酸脱氢酶的作用下生成α-酮戊二酸，α-酮戊二酸是谷氨酸合成的直接前体。•α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶作用下经还原氨基化反应生成谷氨酸CO2固定酶系活力强Citratesynthase,Aconitase,ICDH,GDH酶活力强乙醛酸循环弱异柠檬酸裂解酶活力欠缺或微弱α-酮戊二酸氧化能力缺失或微弱谷氨酸脱氢酶能力强控制谷氨酸合成的重要措施乙醛酸循环的作用谷氨酸发酵的代谢途径乙醛酸循环途径可看作三羧酸循环的支路和中间产物的补给途径在菌体生长期之后，进入谷氨酸生成期，为了大量生成、积累谷氨酸，最好没有异柠檬酸裂解酶催化反应，封闭乙醛酸循环•谷氨酸发酵过程中，生物素缺乏时，菌种生长十分缓慢；生物素过量时，则转为乳酸发酵；生物素亚适量条件下，谷氨酸产量高。影响谷氨酸代谢途径的因素（2）谷氨酸发酵工艺控制•①接种量：一般为0.6％~l.7％。由发酵培养基成分、谷氨酸菌种种类性质、种龄等确定。••②温度控制：前期32±6℃，后期可提高到34℃~37℃。•③pH值：前期pH偏低，则菌体生长旺盛，长菌不产酸；pH偏高，菌体生长缓慢，发酵时间长。•一般前期pH值控制在7.5~8.0较为合适，发酵中、后期将pH值控制在7.0~7.6，常采用氨水流加法或尿素流加法调节pH。•④通风量：长菌阶段，若供氧过量，在生物素限量的情况下，抑制菌体生长，表现为耗糖慢，长菌慢，所以发酵前期以低通风量为宜；发酵阶段，供氧不足，发酵主产物由谷氨酸变为乳酸，所以发酵中、后期以高通风量为宜。1．谷氨酸生产原料•包括碳源、氮源、无机盐和生长因子等。•发酵原料选择要考虑：菌体生长繁殖的营养需求、有利于谷氨酸大量积累、产品提取容易、生产周期短及价格便宜。•（1）碳源：是构成菌体和合成谷氨酸的碳骨架以及能量来源。•一般都是淀粉原料，如玉米、小麦、甘薯、大米等。淀粉先水解成葡萄糖，然后经中和、脱色再投放到发酵罐。•也可用糖蜜原料作碳源，糖蜜因富含生物素，发酵前需除去或破坏生物素。•（2）氮源：是合成菌体蛋白质、核酸及谷氨酸的原料。氮源比碳源对谷氨酸发酵影响更大，约85％的氮源被用于合成谷氨酸，15％用于合成菌体。•一般发酵工业碳氮比为100:(0.2~2.0)，谷氨酸发酵的碳氮比为100:(15~21)。•目前多用尿素作为氮源，分批流加，流加时温度不易过高(不超过45℃)，否则游离氨过多，使初始pH过高，抑制菌体生长。（3）无机盐：是微生物维持生命活动不可缺少的物质。其中磷酸盐在谷氨酸发酵中非常重要，是谷氨酸发酵过程必需的，但浓度不能过高，否则会转向缬氨酸发酵。（4）生长因子：谷氨酸生产菌都是生物素缺陷型，生物素为其生长因子。2．谷氨酸生产菌及其扩大培养•（1）谷氨酸生产菌•目前谷氨酸发酵菌种有谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌、黄色短杆菌、嗜氨小杆菌、球形节杆菌。•报道的谷氨酸生产菌中，除芽孢杆菌外，虽然它们属于不同的属种，但都有一些共同特点，如菌体为球形、短杆至棒状、无鞭毛、不运动、不形成芽孢、呈革兰氏阳性、需要生物素做生长因子、在通气条件下培养产生谷氨酸。•（2）扩大培养(二级种子培养流程)：•斜面菌种→一级种子培养→二级种子培养→发酵罐。4．谷氨酸的提取工艺•主要根据其两性电解质性质、溶解度和吸附剂的作用以及谷氨酸的成盐作用等。•目前常用方法有等电点法、离子交换法、锌盐法、纳滤膜等。（1）等电点法提取谷氨酸•①原理：谷氨酸分子含有两个酸性羧基和一个碱性氨基，酸性条件下，即pH＜3.22时，α-羧基的电离受抑制，谷氨酸主要以阳离子形式存在，带正电荷；当pH＞3.22时，谷氨酸主要以阴离子形式存在，带负电荷；当pH＝3.22时（即等电点pI），谷氨酸净电荷为零，呈电中性，溶解度最小，从溶液中析出，通过过滤、离心等可提取出谷氨酸。•谷氨酸晶体有两种，分别是α-型和β-型。•α-型晶轴长短接近，晶体粗壮，颗粒大，易沉淀分离，是理想晶体。•β-型晶轴长短不一，针状或鳞片状，晶粒微细，不易沉淀析出，所以操作中，需控制条件以利于形成α-型。等电点提取谷氨酸工艺流程5．味精的生产•味精化学名称为谷氨酸钠，是通过对谷氨酸的进一步加工制得的具有特别鲜味的调昧品。•（1）味精的生产工艺流程：在谷氨酸生产基础上通过中和、脱色和除铁等处理，制得谷氨酸钠晶体。谷氨酸制味精的工艺流程（2）味精生产工艺控制：•①中和：将谷氨酸加水溶解，用碳酸钠或氢氧化钠中和。•应使谷氨酸一钠(单钠盐)生成量最大，中和时，应先加谷氨酸后加碱，开启搅拌，温度控制在65℃左右(低于70℃)，中和液浓度21°Bé~24°Bé，pH5.6~6.8，控制pH不超过7，否则形成二钠盐。•②中和液的脱色与除铁：脱色及除铁后，液体透光率达到90％以上，二价铁离子浓度低于5mg·L-1。可用活性炭脱色，Na2S或离子交换树脂除铁。•③中和液的浓缩和结晶：减压浓缩，加入晶种诱导结晶。•④味精的干燥及包装：干燥后经化验，含量符合国家标准后，配入精盐，真空抽取至混合器混合15min，放出即为成品。8.2赖氨酸的发酵生产•赖氨酸是一种必需氨基酸，可以促进儿童发育，增强体质，补充适量L-赖氨酸，可大大提高蛋白质的利用率，L-赖氨酸被广泛用于食品强化剂、饲料添加剂及医疗保健、滋补饮料等方面，是一个具有广泛市场的氨基酸产品。•目前全世界产量已达10万吨，而且还呈上升趋势，其中日本占世界产量的60％，我国赖氨酸生产水平还有待提高。赖氨酸生产工艺流程游离的赖氨酸容易吸收空气中二氧化碳，制得赖氨酸晶体比较困难，一般工业赖氨酸产品以赖氨酸盐酸盐形式生产。1．赖氨酸的生产原料及菌种•碳源一般是玉米、山芋等淀粉原料水解后制得，也可利用糖蜜。碳源浓度不宜过高，否则对菌体生长不利，赖基酸转化率降低。赖氨酸是二氨基碱性氨基酸，所以发酵时添加的氮源相对于其他氨基酸要多。常用氮源是硫酸铵和氯化铵。•赖氨酸生产菌有两大类：一类是细菌，多以谷氨酸生产菌为出发菌通过诱变制得；另一类是酵母菌，但产量较细菌低。2．赖氨酸生产工艺控制•（1）赖氨酸的生物合成途径•赖氨酸合成途径与其他氨基酸不同，依微生物种类不同而异。•细菌赖氨酸生物合成途径需天冬氨酸经过反应合成二氨基庚二酸，进而合成赖氨酸，不同细菌生物合成调节机制不同；•酵母赖氨酸合成途径需天冬氨酸经过反应合成α-氨基已二酸，再合成赖氨酸。（2）赖氨酸发酵工艺控制•①赖氨酸发酵工艺条件：控制溶解氧浓度对赖氨酸发酵很重要，供氧不足，将导致乳酸积累，并可能导致赖氨酸生产受到不可逆抑制，该抑制作用和细胞膜透性有关。•因为供氧不足使细胞体内的赖氨酸和磷脂含量增加，而发酵液中赖氨酸含量很低。•发酵时，前期温度为32℃，中后期为34℃。pH控制在6.5~7.5，最适pH为7.0，可通过补加尿素或氨水来控制其pH值。•②培养基中苏氨酸、蛋氨酸的控制：赖氨酸生产菌都是高丝氨酸缺陷型，苏氨酸和蛋氨酸是赖氨酸生产菌的生长因子，在发酵过程中，如果培养基中两者含量丰富，就会只长菌，而不产或少产赖氨酸，所以在发酵时，将苏氨酸和蛋氨酸控制在亚适量，以提高赖氨酸产量。•③发酵中生物素控制：赖氨酸生产菌多由谷氨酸生产菌诱变而来，都是生物素缺陷型，培养基中限量添加生物素，会导致发酵转向谷氨酸方向，大量积累谷氨酸。如果培养基中添加过量生物素，会使细胞内合成的谷氨酸对谷氨酸脱氢酶发生抑制作用，则抑制谷氨酸合成，从而转向天冬氨酸，大量积累赖氨酸。④发酵时物质的添加某些物质对赖氨酸产量的影响3．赖氨酸的提取•其下游加工包括发酵液预处理、提取、精制三个阶段。•（1）发酵液顶处理•发酵液中加入絮凝剂(明矾等)絮凝后过滤除菌体，也可高速离心进行固-液分离，回收菌体进一步加工利用，滤液用盐酸调节pH4.0后备用。•（2）赖氨酸提取方法：有沉淀法、有机溶剂抽提法、离子交换、电渗析四种方法。工业上多采用离子（强酸性）交换法来提取。•赖氨酸是碱性氨基酸，等电点为9.59。•在pH2.0左右被强酸性阳离子交换树脂所吸附；在pH7.0~9.0时被弱酸性阳离子交换树脂所吸附。•强酸性阳离子交换树脂的氢型对赖氨酸的吸附比铵型容易得多，但是铵型能选择性地吸附赖氨酸和其他碱性氨基酸，不吸附中性和酸性氨基酸，同时在用氨水洗脱赖氨酸后树脂不必再生。•所以多选铵型强酸性阳离子交换树脂。①树脂的处理过程：732#阳离子树脂水洗1mol/L的NaOH处理水洗至pH6.0水洗至pH8.01Mol/L的HCl处理1Mol/L的氨水处理水洗至pH8.0铵型树脂（待用）•②离子交换操作方式：用动态法离子交换柱交换操作方式，采用多柱串联。•③水洗：用水洗柱至呈中性，以除去可溶性和非可溶性杂质，以提高赖氨酸质量。•④氨水洗脱：后面的洗脱液含赖氨酸少而含氨量高，并于洗脱用氨水中，以提高收集率。•⑤浓缩结晶：真空浓缩除氨，用盐酸调pH4.9，再减压浓缩，5℃静置结晶2天，得赖氨酸盐酸盐晶体粗品。•（3）赖氨酸的精制•粗品50℃搅拌溶于去离子水，活性炭60℃保温脱色1h，趁热过滤，滤液冷却后5℃结晶2天。•滤取结晶真空干燥或热风干燥，即得赖氨酸盐酸盐成品。8.3其他氨基酸的发酵生产•1．苏氨酸发酵•用于饲料工业、保健食品和医药工业。目