第二章 产酶微生物的分离与筛选

Chapter2IsolationandPurificationofMicroorganismsProducingEnzyme产酶微生物的分离与纯化酶的生产方法提取分离法(Extraction)生物合成(Biosynthesis)化学合成(Chemicalsynthesis)SOD-bloodPapain-PapayaChymotrypsin-Pancrea……organ/tissue/cellAmylasefromBacillusProteasefromBacillusPhosphatasefromBacillusGlucoamylasefromAspergillus……PlantcellcultureAnimalcellcultureFewexampleContentsofchapter22.1产酶微生物2.2产酶微生物的分离和筛选2.3产酶微生物优良菌种的选育2.4产酶微生物原生质体融合育种2.5基因工程育种2.1常见产酶微生物基本要求：不是致病菌发酵周期短,产酶量高不易变异退化最好是产生胞外酶的菌种,利于分离。对医药和食品用酶,还应考虑安全性：凡从可食部分或食品加工中传统使用的微生物生产的酶,安全!由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性实验。非常见微生物制取的酶,需做广泛的毒性实验,包括慢性中毒实验。(1)大肠埃希氏杆菌，简称为大肠杆菌，是最为著名的原核生物。形态：短杆或长杆状，0.5～1.0×1.0～3.0um，革兰氏阴性，运动(周毛)或不运动，无芽孢，一般无荚膜。菌落呈白色至黄白色，扩展，光滑，闪光。Escherich属菌株和大多数大肠杆菌是无害，但也有些大肠杆菌是致病的，会引起腹泻和尿路感染。大肠杆菌的名声主要因它易于在实验室操作、生长迅速，而且营养要求低。应用：大肠杆菌能作为宿主供大量的细菌病毒生长繁殖大肠杆菌也是最早用作基因工程的宿主菌工业上生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶和制备天冬氨酸、苏氨酸及缬氨酸等(2)醋酸杆菌（Acetobacter）菌体从椭圆至杆状，单个、成对或成链，革兰氏阴性，运动（周毛）或不运动，不生芽孢。好气。含糖、乙醇和酵母膏的培养基上生长良好。应用：有机酸(食醋等）葡萄糖异构酶(高果糖浆)山梨糖(维C中间体）(3)枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）直状、近直状的杆菌，周生或侧生鞭毛，革兰氏阳性，无荚膜，芽孢0.5×1.51.8m，中生或近中生。枯草芽孢杆菌是工业发酵的重要菌种之一。生产淀粉酶、蛋白酶、5’-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。(4)根霉(Rhizopus)分类学上属于藻状菌纲，毛霉目，根霉属。根霉因有假根（Rhizoid）而得名（假根的功能是在培养基上固着，并吸收营养）。分布于土壤、空气中，常见于淀粉食品上，可引起霉腐变质和水果、蔬菜的腐烂。代表种：米根霉（R.oryzae)黑根霉(R.nigrican)等。应用：根霉能产生一些酶类，如淀粉酶、果胶酶、脂肪酶等，是生产这些酶类的菌种。在酿酒工业上常用做糖化菌。有些根霉还能产生乳酸、延胡索酸等有机酸。(6)曲霉(Aspergillus)分类：多数属于子囊菌亚门，少数属于半知菌亚门。分布：广泛分布于土壤、空气和谷物上，可引起食物、谷物和果蔬的霉腐变质，有的可产生致癌性的黄曲霉毒素。代表种：黑曲霉Asp.Niger、黄曲霉Asp.flavus应用：是制酱、酿酒、制醋的主要菌种。是生产酶制剂（蛋白酶、淀粉酶、果胶酶）的菌种。生产有机酸（如柠檬酸、葡萄糖酸等）。农业上用作生产糖化饲料的菌种。回本节菌种选育野生菌自发突变杂交育种原生质体融合基因工程诱变育种2.2产酶微生物的分离与筛选2.2.1样品的采集根据所要分离的微生物的特点：纤维素酶：堆积和腐烂纤维素的地方—褐腐态树木上果胶酶：霉烂的果蔬上淀粉酶：酿酒厂、淀粉厂周围的土壤蛋白酶：肉质、豆制品常厂的周围不了解产酶微生物的具体来源—土壤2.2.2富集培养1.添加特殊的营养物质2.调整培养基的酸碱度3.控制培养温度和热处理4.添加抑制剂2.2.3分离通常采用平板分离法。将含菌样品用无菌水或生理盐水稀释到适当的浓度，然后涂布在适当的平板上，根据微生物的种类选择培养条件。根据不同的微生物种类采用不同的培养基、抑制剂。1.胞外酶的产酶菌株的筛选方法2.胞内酶的产酶菌株的筛选方法如果是胞内酶，则可采用以下两种方法来确定：(1)固体培养法把菌种接入固体培养基中，保温数天，用水或缓冲液浸泡培养基，将酶抽提，测定酶活力，这种方法主要适用于霉菌；(2)液体培养法将菌种接入液体培养基后，静置或在摇床上振荡培养一段时间(视菌种而异)，再测定培养物中酶的活力，通过比较，筛选出产酶性能较高的菌种供复筛使用。2.2.4初筛2.2.4初筛通过平板分离的初筛法得到的产酶军注重，需要进一步复筛。复筛时可以采用几种代表性的培养基，在预定的几种培养条件下，对每一个菌株进行培养，并测定其产酶能力。由于同一种菌株可因培养方式的不同表现出不同的产酶能力，因此，最好将摇瓶实验和小发酵罐实验相结合判断菌株的优良性。2.3产酶微生物优良菌种的选育2.3.1优良菌种的诱变育种诱变育种：是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学研究用。1.诱变育种2诱变育种方法诱变育种的基本过程如下：选择合适的出发菌株→制备待处理的菌悬液→诱变处理→筛选→保藏和扩大试验（1）出发菌株的选择a.自然界直接分离到的野生型菌株b.经历过生产条件考验的菌株c.已经历多次育种处理的菌株(2)制备菌悬液a.待处理的菌悬液应考虑微生物的生理状态、悬液的均一性和环境条件。一般要求菌体处于对数生长期，并采取一定的措施促使细胞处于同步生长。b.菌悬液的细胞浓度一般控制为：真菌孢子或酵母细胞106～107个/ml，放线菌或细菌108个/ml。菌悬液一般用生理盐水(0.85%NaCl)稀释。表型延迟Phenotypiclag：所谓的表型延迟就是指某一突变在DNA复制和细胞分裂后，才在细胞表型上显示出来，造成不纯的菌落。生理性延迟现象：生理性延迟现象，就是虽然菌体发生了突变，并且突变基因由杂合状态变成了纯合状态，但仍不表现出突变性状。(3)诱变处理通常是根据经验选择恰当的诱变剂,对于已有诱变处理背景的菌株，变换使用其它诱变剂也许会得到较好的效果。要确定一个合适的剂量，常常需要经过多次试验。就一般微生物而言，突变率随剂量的增大而增高，但达到一定剂量后，再加大剂量反而会使突变率下降。对于诱变剂的具体用量有不同的看法。有人认为应采用高剂量，就是造成菌体致死率在90%～99.9%时的剂量是合适的，这样能获得较高的正突变率，并且淘汰了大部分菌体，减轻了筛选工作的负担。许多人倾向于采用低剂量(致死率在70%～80%),甚至更低剂量(致死率在30%～70%)，他们认为低剂量处理能提高正突变率，而负突变较多地出现在偏高的剂量中。诱变剂及其诱发机理1.物理诱变剂物理诱变主要是采用辐射。如紫外线、X射线、γ射线、激光和快中子等都是常用的物理诱变剂。生物中核酸物质的最大紫外线吸收峰值在265nm波长处，该波长也是微生物的最敏感点。紫外线诱变机理是它会造成DNA链的断裂，或使DNA分子内或分子之间发生交联反应。a.交联是由二聚体引起的，二聚体可以在同一条链相邻的碱基之间产生，也可以是在二条链的碱基之间形成。它会引起DNA复制错误，正常的碱基无法配对，造成错义或缺失。嘧啶比嘌呤对紫外线敏感得多。b.过量的紫外线照射会造成菌体丢失大段的DNA，或使交联的DNA无法打开，不能进行复制和转录，从而引起菌体死亡。c.在正常的微生物细胞中，紫外线造成的DNA损伤是可以得到及时修复的。光复活作用(photoreactivation)：若将受紫外线照射后的细胞立即暴露在可见光下，菌体的突变率和致死率均会下降。光复活作用是因为微生物等生物的细胞内存在光复活酶(photoreactivatingenzyme)。光复活酶会识别胸腺嘧啶二聚体，并与之结合形成复合物，此时的光复活酶没有活性。可见光光能(300-500nm)可以激活光复活酶，使之打开二聚体，将DNA复原。与此同时，光复活酶也从复合物中释放出来，以便重新执行光复活功能.暗修复(darkrepair)作用：可修复由紫外线、γ射线和烷化剂等对DNA造成的损伤。野生型大肠杆菌细胞的切除修复系统非但可以修复自身的DNA紫外线损伤，还能修复外来的噬菌体T1及T3等的DNA所受到的紫外线损伤。重组修复(recombinationrepair)：重组修复必须在DNA进行复制的情况下进行，所以又称为复制后修复。在不切除胸腺嘧啶二聚体的情况下，以带有二聚体的这条链为模板合成互补单链，可是在每个二聚体附近留一空隙。对于重组修复的机制并不象切除修复了解得那样具体，一般认为通过染色体交换，空隙部位就不再面对着胸腺嘧啶二聚体而是面对着正常的单链，在这种条件下DNA聚合酶和连接酶便起作用把空隙部位进行修复。2.化学诱变剂(1)与碱基化学反应的诱变剂:烷化剂、亚硝酸和羟胺烷化剂(alkylatingagent)：带有一个或多个活性烷基，带一个活性烷基称单功能烷化剂，带二个或多个的分别称为双功能或多功能烷化剂。它们的烷基可转移至其它分子中电子密度高的位置，它们的诱变作用是其与DNA中的碱基或磷酸作用。常见的烷化剂有硫酸二乙酯(EDS)、甲基磺酸乙酯(EMS)、N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、亚硝基甲基脲(NMU)、氮芥、乙烯亚胺和环氧乙酸等。碱基中的鸟嘌呤最易受烷化剂作用，形成6-烷基鸟嘌呤，并与胸腺嘧啶错误配对，造成碱基转换。胸腺嘧啶被烷基化后，可与鸟嘌呤错误配对。(2)碱基类似物:有5-溴尿嘧啶(5-BU)，5-氟尿嘧啶(5-FU)、8氮鸟嘌呤(8-NG)和2-氨基嘌呤(2-AP)它们与碱基的结构类似，在DNA复制时，它们可以被错误地掺入DNA，引起诱变效应，所以说它们引起碱基置换的作用是间接的。(3)移码突变的诱变剂:吖啶类染料(原黄素、吖啶黄、吖啶橙及α-氨基吖啶等)和称为ICR类的化合物移码突变:是指由一种诱变剂引起DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的插入或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和翻译错误的一类突变。由移码突变产生的突变体称为移码突变体。作用机制：它们是一种平面型的三环分子，与嘌呤-嘧啶碱基对的结构十分相似，故能嵌入两个相邻的DNA碱基对之间，造成双螺旋的部分解开(两个碱基对原来相距0.34纳米，当嵌入一个吖啶类分子时，就变成0.68纳米)，从而在DNA复制过程中，会使链中增添或缺失一个碱基，结果引起移码突变。突变是随机不定向的，但是筛选是定向的。筛选的条件决定选育的方向，因为突变体高产性能总是在一定的培养条件才能表现出来。在一个适于突变株繁殖的特定条件下可以筛选得到具有新性状的菌株，其他原养型菌株则逐步被淘汰。所以，培养基和培养条件是决定菌种某些特性保留或淘汰的筛子。为了有效地筛选突变株，必须采用使新个体表型得以充分表达的筛选条件。首先要设计一个良好的筛选培养基和确定合适的培养条件。培养基无论从组成成分、浓度、配比、pH值都要有利于突变株优良性状的表现。同时，培养基和培养条件应尽量力求和大生产条件一致，才能使选育的菌株应用于工业大生产。2.3.2突变株的分离与筛选1.常规的筛选程序这是传统选育中常用的方法，挑选的菌落直接接入摇瓶培养，产物用常规法测定。第一代：出发菌株诱变分离到平皿上（有时还结合指示剂，呈色剂或底物等）挑选菌落200个初筛1瓶/株50株复筛3~5株（提供第二代诱变出发菌株）第二代：出发菌株4株诱变分离到平皿上（有时还结合指示剂，呈色剂或底物等）挑选菌100个菌落100个菌落100个菌落100个菌落初筛1瓶/株50株复筛3~5株（提供第三代诱变出发菌株）第三代、第四代…直到选育到符合要求的优良菌株2.简便筛选程序在常规筛选法基础上进一步改进：一方