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实验基础技能培训李玉涛2017-07•Part1血液基本成分及其分离方法•Part2离心机简介及使用Part1血液基本成分及其分离方法一、血液基本成分二、血液物理性质三、血液采集常用方法四、血液成分分离方法一、血液基本成分血细胞形态、数量、比例和血红蛋白含量的测定称为血像。患病时，血像常有显著变化，故检查血像对了解机体状况和诊断疾病十分重要。1、红细胞•红细胞（erythrocyte，redbloodcell）直径7～8.5μm，呈双凹圆盘状，中央较薄（1.0μm），周缘较厚（2.0μm）•红细胞的这种形态使它具有较大的表面积（约140μm2），便于携O2和部分CO2。•成熟红细胞无细胞核，也无细胞器，胞质内充满血红蛋白（hemoglobin,Hb）。•红细胞的渗透压与血浆相等，使出入红细胞的水分维持平衡。当血浆渗透压降低时，过量水分进入细胞，细胞膨胀成球形，甚至破裂，血红蛋白逸出，称为溶血（hemolysis）2、白细胞•白细胞（leukocyte,whitebloodcell）为无色有核的球形细胞，体积比红细胞大，能作变形运动，具有防御和免疫功能。白细胞分类光镜下，根据白细胞胞质有无特殊颗粒，可将其分为有粒白细胞和无粒白细胞两类。有粒白细胞又根据颗粒的嗜色性，分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。无粒白细胞有单核细胞和淋巴细胞两种。2.1、中性粒细胞•中性粒细胞（neutrophilicgranulocyte,neutrophil）占白细胞总数的50%－70%，是白细胞中数量最多的一种。具有活跃的变形运动和吞噬功能。•细胞呈球形，直径10－12μm，核染色质呈团块状。核的形态多样，有的呈腊肠状，称杆状核；有的呈分叶状，叶间有细丝相连，称分叶核。中性粒细胞异常•中性粒细胞增高见于：a．急性感染和化脓性感染：肺炎、败血症、脓肿等。b．组织损伤：大手术后、心肌梗塞、肺梗塞等。c．恶性肿瘤：急、慢性白血病、淋巴瘤等。d．各种中毒：尿毒症、糖尿病酸中毒等。•中性粒细胞减少见于：a．某些传染病：流感、伤寒、付伤寒、麻疹。b．某些血液病：再障、粒细胞缺乏症、白细胞减少症。c．化疗或放疗后，抗癌药物，X线及镭照射。d．其它：脾功能亢进，自身免疫性疾病，高度恶病质。2.2、嗜酸性粒细胞•嗜酸性粒细胞（eosinophilicgranulocyte,eosinophil）占白细胞总数的0.5%－3%。与变态反应有关，并有吞噬抗原抗体复合物的作用。•细胞呈球形，直径10～15μm，核常为2叶，胞质内充满粗大（直径0.5～1.0μm）、均匀、略带折光性的嗜酸性颗粒，染成桔红色。嗜酸性粒细胞异常•嗜酸性粒细胞增多见于：a．变态反应性疾病：支气管哮喘、药物过敏、荨麻疹等。b．寄生虫病：蛔虫病、钩虫病、血吸虫病。c．某些皮肤病：湿疹、牛皮癣、剥脱性皮炎等。d．某些血液病：慢粒、恶性淋巴瘤、嗜酸性粒细胞性白血症等。•嗜酸性粒细胞减少见于：a．应用糖皮质激素、促肾上腺皮质激素。b．伤寒、副伤寒等病患者。2.3、嗜碱性粒细胞•嗜碱性粒细胞（basoophilicgranulocyte,basophil）数量最少，占白细胞总数的0～0.15。•细胞呈球形，直径10－12μm。胞核分叶或呈S形或不规则形，着色较浅。胞质内含有嗜碱性颗粒•嗜碱性粒细胞主要参与特殊的免疫反应。嗜碱性粒细胞异常•增多见于：a．慢性粒细胞白血病、嗜碱性粒细胞白血病。b．某些转移癌及骨髓纤维化。•减少一般无临床意义。2.4、淋巴细胞•淋巴细胞（lymphocyte）占白细胞总数的20%～30%，圆形或椭圆形，大小不等。•T细胞约占淋巴细胞总数的75%，参与细胞免疫，如排斥异移体移植物、抗肿瘤等，并具有免疫调节功能。•B细胞约占血中淋巴细胞总数的10%～15%。B细胞受抗原刺激后增殖分化为浆细胞，产生抗体，参与体液免疫。淋巴细胞异常•增多见于：a．某些病毒或细胞所致的传染病：传染性淋巴细胞增多症、传染性单核细胞增多症、传染病恢复期、结核病、百日咳。b．淋巴细胞性白血病、白血性淋巴肉瘤。•减少见于：a．应用肾上腺皮质激素、接触放射线。b．细胞免疫缺陷病、某些传染病的急性期。2.5、单核细胞•单核细胞（monocyte）占白细胞总数的3%～8%。具有游走性和吞噬作用。•单核细胞为白细胞中体积最大的细胞。直径14～20μm，呈圆形或椭圆形。胞核形态多样，呈卵圆形、肾形、马蹄形或不规则形等。胞质较多，呈弱嗜碱性，含有许多细小的嗜天青颗粒单核细胞异常•增多见于：a．某些感染：伤寒、结核、疟疾、黑热病、亚急性细菌性心内膜炎。b．某些血液病：单核细胞性白血病、淋巴瘤、骨髓异常增殖综合症、恶性组织细胞病。•减少一般无临床意义。二、血液物理特性•血液密度为1.050—1.060×10^3kg/m^3，•红细胞的密度为1.090×10^3kg/m^3，•血浆的密度为1.025—1.030×10^3kg/m^3。血液的颜色•通常抽的是静脉血，所以外观看上去呈暗红色。•若血含较多的是高铁血红蛋白或其他血红蛋白衍生物，则呈紫黑色。•血浆（或血清）因含少量胆红素，看上去呈透明淡黄色；•若含乳糜微粒，则呈乳白浑浊；•若发生溶血，则呈红色血浆。三、血液采集常用方法•红色试管帽采血管采血管中不含任何添加剂，适用于常规生化血清检验，对检验结果无影响，缺点：离心不到位或者温育时间不够，容易形成纤维蛋白，容易堵塞设备针孔三、血液采集常用方法•紫色试管帽采血管采血管中含EDTA-K2抗凝剂，一般采取喷雾制作，使得抗凝剂均匀分布管壁，制备标本为全血，一般适用于常规的血液学检测常用抗凝剂（1）•乙二胺四乙酸二钠（简称EDTANa2）–抗凝原理：可螯合血液中的钙离子而阻止血液凝固。–优点：抗凝作用强，且不改变血细胞的形态和体积，可防止血小板聚集。–应用：适于血液学检验，但输血不能用。•草酸盐合剂（草酸钾及草酸铵合剂）–抗凝原理：夺取血中的游离钙而形成不溶解的草酸钙，而达到抗凝。–优点：溶解度大，抗凝作用强。–缺点：草酸钾使红细胞缩小约6％，而草酸铵可使红细胞膨胀。–应用：适于除红细胞压积容量测定的血液检验。常用抗凝剂（2）•枸橼酸钠（柠檬酸钠）–抗凝原理：与血中游离钙离子形成非离子化的可溶性的枸橼酸钙复合物，从而阻止血液凝固。–优点：与血中游离钙离子结合松散。–缺点：引起水及无机盐在血细胞及血浆之间分布的改变。–应用：常用于血沉淀及输血时的抗凝，不适用于血液化学检验。•肝素–抗凝原理：阻止血中的凝血酶原转变为凝血酶，防止血凝。–优点：抗凝作用强，不影响红细胞的大小，对血液化学分析干扰少。–缺点：价格贵，抗凝时间短，其抗凝血做白细胞分数计数时，白细胞着色不佳。–应用：血液有机成分、无机成分的分析。四、血液成分分离1血清血浆分离2白细胞分离2.1裂解红细胞法2.2Ficoll分离法1、血清血浆的分离•血清和血浆的最大区别就是血清中不含纤维蛋白原•紫色采血管颠倒混匀后，1200g离心10min，4度，取上清。•红色采血管需用枪头搅匀后，1200g离心10min，4度，取上清2.1、白细胞分离-裂解红细胞法•红细胞裂解液主要成分：NH4Cl，KHCO3，Na2EDTA•红细胞裂解液裂解原理：氯化铵通过在其细胞膜进行氢氧根／碳酸氢根和氯离子的交换，改变其渗透压，造成红细胞胀大破裂；外周血淋巴细胞受影响较少因其细胞膜的离子转运通道不同。2.1、白细胞分离-裂解红细胞法主要实验流程：•将10X储存液稀释到1X工作浓度；•加入血沉棕黄层的6-10倍体积的1X红细胞裂解液，吹打均匀•冰上裂解10分钟。裂解完毕后，50ml离心管中液体应呈透明红色，且下方无红色沉淀。•1500g，10min，4度离心，弃去上层液体，仅保留下层白色沉淀。2.2、白细胞分离-Ficoll分离法•原理:常用来分离人外周血单个核细胞（PBMC）的分层液比重是1.077±0.001的聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F／H)分层液。Ficoll是蔗糖的多聚体，中性，平均分子量为400,000，不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。2.2、白细胞分离-Ficoll分离法Part2离心机简介及使用、离心机简介•离心机借助转轴高速旋转产生离心力，使不同密度、不同大小的物质分开，能达到初步分离纯化的目的，是实验室必不可少的仪器。•按照转速可以分为低速(8000rpm)、高速(8000-20000)、超速(50000)三种类型。根据体积大小和摆放位置又可分为台式离心机和落地式离心机。台式离心机体积比较小，常是中低速离心机；落地式离心机体积较大，常带有降控温装置，大多是高速离心机。2、离心机的摆放•离心机一般放在干燥、避免阳光直射的地方。•离心机散热量比较大，周围不要堆放杂物，四周离墙壁、挡板等不透气、散热性差的物品至少10cm以上。•离心机尽量单独放在一个房间，周围绝对不要放有机试剂、易燃品3、离心机使用注意事项•根据实验所需和使用的离心管，含有有机试剂的液体要用特殊的离心管；•选择合适的转头，转速绝对禁止超过转头标明的最高转速。•离心管的对称放置和重量配平，同时应该注意离心管和转头可以承受的最大重量的溶液，液体最多装离心管全体积的3/4。4、离心机保养•每次使用完毕，都要将离心机盖儿打开，使得热量或者水气自然蒸发，如之前使用了低温离心，可能有结冰，则要等冰融化，及时用干燥棉纱布擦洗干净，等无明显水汽时再盖上盖子。•如果离心机转头可以替换，则每个转头使用完毕后都要及时取出，用干净的、干燥的医用纱布擦洗干净，倒扣放置，切勿使用锐器刮擦。•操作人员离开时候要切断电源。5、具体操作流程（1）1.设定使用温度（通常为4℃）后，先把离心陀放入离心舱中，注意离心陀要卡好轴心；关上舱门，离心舱的温度开始下降，预冷时间要充足。2.把样本装入适当的离心管，双双用天平平衡重量，盖上离心管盖子并旋紧。1）注意离心管只装七成满，虽然加有盖子，但也可能因离心力太强而外泄。2）离心管通常都会放在碎冰上，注意取出平衡时，要把碎冰的液体擦拭干净。3）落单的离心管要用另一只装有清水的离心管平衡。3.把平衡好的离心管对称地放入离心陀中，盖上离心陀的盖子，注意有无旋紧。4.关上离心机舱门，在仪表板上调好所要的转速与时间。5.确定所有步骤无误后，按Start钮开动，离心机渐渐加速，此时要密切监控。1）如在运行中听到不正常声音或者闻到什么异味，应立即采取刹车，按“停止”键，必要时还要切断电源。2）仪器运行期间，绝对禁止打开离心机盖3）等到离心达到所要的转速后，确定一切正常才可离去5、具体操作流程（2）6.完成离心时，要等离心陀完全静止后，才能打开舱门；请尽快取出离心管，先观察离心管是否完全，以及沉淀的位置。1）若不慎将上清和沉淀混在一起，就要重来一次。2）若离心管有漏，要找出原因，并且立刻清理离心陀或离心舱。7.在两次离心之间的空档，不需取出离心陀，但盖上舱门，勿让热空气流入离心舱。8.全部使用完毕后，取出离心陀清理。离心舱门要打开，等结冰融化后，再稍加擦拭及清理，若有液体漏出，要用清水洗之。也要回头检查平衡离心管的天平以及桌面。9.实验室人员养成良好的登记习惯，第一可以知道之前谁用过，之前用时仪器状况；第二可以知道离心机使用的次数，从而得知是否需要检修或者更换。