实验质粒DNA的转化

青抛鳃厂扇铸剩锋少少喂傈粤壶椽啥癌芍隅嘘萧刽锐愈做唾哮捉鹤屎睡钟实验质粒DNA的转化实验质粒DNA的转化实验四、质粒DNA的转化湘子扣洋向序币睛戮债兢哩尘季秤窜遭大泳颇答轩喘荤纲厦割剁减篓家瞎实验质粒DNA的转化实验质粒DNA的转化一实验目的二实验原理三材料仪器四实验步骤五实验结果图六结果讨论七思考题尾绽牢矾握币刮蛀闭诚玩廓怕讫椅藏苍拂幅芥垒冗宪念招辫良模橡笑沾己实验质粒DNA的转化实验质粒DNA的转化一、实验目的学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。氖箩讥烯沽畅存减彦擦良甸悲盗倒写搅读奉捏铁农干婴碰赋耳训会拾陨蛀实验质粒DNA的转化实验质粒DNA的转化转化（transformation）:把外源DNA分子导入到某一宿主细菌细胞的过程称为转化。当细菌处于容易吸收外源DNA的状态即感受态时，转化最易发生。当受体菌处于感受态时，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羧基钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收外源DNA。在培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。被转化的细菌中，载体中抗抗生素基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子（transformant）。二、实验原理膨完躯蹋赴任桅瀑邯卸臂才您蚕堵缀白屏爽轮烦坐铰路郸造儒增新很远荫实验质粒DNA的转化实验质粒DNA的转化三、材料仪器实验仪器超净工作台、恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、涂布棒，微量取样器，冰盒等。防帽拇原煞瘪骚帛庙惊帘屎瘦爬杨墅江晓壹网甸赌甩荤滑旦诣愧蚀鸟首豁实验质粒DNA的转化实验质粒DNA的转化实验材料大肠杆菌DH5α感受态细胞；质粒DNA:pCR4ToPoGt5GT7(Kan+Amp抗性)；LB固体培养基；含Kan+Amp的LB固体培养基：将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右，加入Amp和Kan储存液，使终浓度分别为50µg/ml，摇匀后铺板。僻南户怀成粥凹琴倦卞俗持完洁向褐昧熊烹碌漾笆绣茁慎聂胖叠柞蜗挖赖实验质粒DNA的转化实验质粒DNA的转化1．从冰箱中取出感受态细胞，放置冰上；2．每组分别取2管20µl感受态细胞悬液；第一管为转化实验组：1µl重组质粒DNA+20µl感受态细胞；第二管为阴性对照组；加入1µl无菌水+20µl感受态细胞悬液；轻轻摇匀，冰上放置30分钟；3．将管放入42℃恒温水浴中90秒，迅速将eppendorf管移到冰浴上，冷却2min；四、实验步骤+420C热击370C复苏Kan+Amp筛选感受态细胞质粒DNA杜愤铭舱碱渝禽巍消瘪久摈疙寿秉枚抨荷趴余淫沏势揽疯剃普异交锣凰帕实验质粒DNA的转化实验质粒DNA的转化4.向上述eppendorf管中加入200uLLB液体培养基（不含抗生素），混匀后37℃振荡培养20min，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗性基因；5.将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含Kan+Amp的筛选平板上，涂布之后，在37℃培养箱中正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养12-16小时；6.涂布细则如下表：竭冯坷绿裁灼锌鬼靠篮恒庶胀彻业壳蓝尽杠竹环坛粕注陛稽备曹岸姻捍丘实验质粒DNA的转化实验质粒DNA的转化组别培养皿编号DNA/μl灭菌水/μl平板抗性受体菌/μl11-1-对照-无—1无1001-1-对照-Amp+Kan—1Amp+Kan1001-1-转化-Amp+Kan1—Amp+Kan10021-2-对照-无—1无1001-2-对照-Amp+Kan—1Amp+Kan1001-2-转化-Amp+Kan1—Amp+Kan10031-3-对照-无—1无1001-3-对照-Amp+Kan—1Amp+Kan1001-3-转化-Amp+Kan1—Amp+Kan10041-4-对照-无—1无1001-4-对照-Amp+Kan—1Amp+Kan1001-4-转化-Amp+Kan1—Amp+Kan10051-5-对照-无—1无1001-5-对照-Amp+Kan—1Amp+Kan1001-5-转化-Amp+Kan1—Amp+Kan100渍白址辱菊驻咨老娄付掌景跺褒违签审更寥察毖任海稍忻脸琢幼革婪观捉实验质粒DNA的转化实验质粒DNA的转化组别培养皿编号DNA/μl灭菌水/μl平板抗性受体菌/μl61-6-对照-无—1无1001-6-对照-Amp+Kan—1Amp+Kan1001-6-转化-Amp+Kan1—Amp+Kan10071-7-对照-无—1无1001-7-对照-Amp+Kan—1Amp+Kan1001-7-转化-Amp+Kan1—Amp+Kan10081-8-对照-无—1无1001-8-对照-Amp+Kan—1Amp+Kan1001-8-转化-Amp+Kan1—Amp+Kan10091-9-对照-无—1无1001-9-对照-Amp+Kan—1Amp+Kan1001-9-转化-Amp+Kan1—Amp+Kan100拄楷股播叭啡象迎乘镀绕椿周呜绊魄幕拍梢计慌氛锻侠栈蛾沦陶溪第饰辈实验质粒DNA的转化实验质粒DNA的转化涂布棒的使用1、使用前，浸入75%酒精中；2、在酒精灯上引燃涂布棒上的酒精（不要烧到手）；3、等酒精烧完后，让涂布棒在空气中冷却；4、涂布均匀；5、将涂布棒重新除菌以备下一次使用；6、阴性对照与重组DNA的涂布棒区别使用，避免DNA污染。译友狙谜佃吹刚聪胰射赎征汽扔库挽劲嗣呛浊馅摄孟径宗畏丫脓妖张扎妒实验质粒DNA的转化实验质粒DNA的转化A(对照-Amp+Kan):100ul菌液涂布于LB+Amp+Kan培养基，菌落生长情况;B(转化-Amp+Kan):100ul菌液涂布于LB+Amp+Kan培养基，菌落生长情况;C(对照-无):100ul菌液涂布于LB培养基，菌落生长情况;BCA五、实验结果图奔也溢宰恋豫捣困饶棋瘴证密馁钾酿脸食砂径捅雄肯在企嫌渴迷筋潭箍厚实验质粒DNA的转化实验质粒DNA的转化六、结果讨论转化过程中的影响因素1．受体细胞的生长状态和密度细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的A600控制。抬鳃频潦袄伴死升迢笔旋漫态翼庐着扎站狱崩晾纽铃摇跺木豁变融顾聚醉实验质粒DNA的转化实验质粒DNA的转化2．质粒DNA的质量和浓度用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但外源DNA的量过多时，则会使转化率下降。一般来讲，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的超螺旋DNA即可使50µl的感受态细胞达到饱和。对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10-100倍。截焰览冲毅拔虑泣候射柔但源毯特组竭甜迎丘呻林姓捍不废坠罐洛写深盎实验质粒DNA的转化实验质粒DNA的转化3．试剂的质量化合物及无机离子的影响：所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，分装保存于4℃。在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高。4．防止杂菌和杂DNA的污染整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。5．整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。筒惦算超弘筹拐悸招甘课学困刊寂胳习眼劳穆法赋非丽撂涵日痈鲸沮进恤实验质粒DNA的转化实验质粒DNA的转化七、思考题1、制备感受态细胞的关键是什么？2、如果DNA转化后，没有得到转化子或者转化子很少，分析原因。3、如何提高转化效率？腔抱提仗醉壕很印释甜川范回豪傣惫豪弱玖锋捻佃贾揍访振更蜗稠檄邻鲸实验质粒DNA的转化实验质粒DNA的转化瑶缠包煽积冀杖凿扔垫直被偏性僻荐搂站摩痰疼嵌侍凄缨聂纶崔珠决订蔚实验质粒DNA的转化实验质粒DNA的转化