第五章 细菌的遗传分析

第五章细菌的遗传分析细菌是遗传学研究中常用的实验材料■结构简单■个体数量多■繁殖力强■世代周期短■易于突变■易于培养第一节细菌的细胞和基因组第二节大肠杆菌的突变型及筛选第三节大肠杆菌的性别第四节中断杂交与重组作图第五节F′因子与性导第六节转化与转导作图第一节细菌的细胞和基因组一、细菌的细胞二、细菌的基因组有些细菌还含有小的，可自我复制的环状DNA分子，该小的DNA分子称为质粒（plasmid）。第二节大肠杆菌的突变型及筛选一、大肠杆菌的突变类型1.合成代谢功能的突变型■野生型的合成代谢功能正常，可以在基本培养基上生长。■突变型由于基因的改变影响了合成代谢功能，不能在基本培养基上生长，只能在相应的选择培养基上生长。如：Met-、Thi-和Pur-表明这些突变品系分别需要甲硫氨酸、硫胺和嘌呤，而相应的野生型的表型记为Met+、Thi+和Pur+。2.分解代谢功能的突变型■野生型的分解代谢功能正常■突变型由于基因的改变影响了分解代谢功能如：Lac-突变型不能分解乳糖，因此就不能生长在以乳糖为唯一碳源的基本培养基中，而野生型细菌Lac+都能利用乳糖。3.抗性突变型细菌由于某基因的突变而对某些噬菌体或抗菌素产生抗性。如：抗链霉素突变型Str-，相应的野生型为Str+。细菌完全培养基选择培养基突变体处理涂布影印获得二、突变型筛选抗青霉素的菌生长第三节大肠杆菌的性别1946年J.Lederberg和E.Tatum大肠杆菌K12两种不同营养缺陷型菌株：菌株A：met-bio-thr+leu+thi+菌株B：met+bio+thr-leu-thi-注：bio生命素；met蛋氨酸；thr苏氨酸；leu亮氨酸；thi硫氨素。一、细菌接合现象的发现推测：（1）基因重组；（2）遗传转化。U形管实验(B.Davis)结论：（1）否定了遗传转化；（2）证明A与B菌株的直接接触是基因重组的前提。接合：细胞之间通过暂时连接，进行物质交流的现象。即遗传物质从供体（雄性）转移到受体(雌性)内的过程。特点：需通过细胞的直接接触。二、F因子1.Hayes的实验①A菌（链霉素处理）×B菌→原养型菌落②A菌×B菌（链霉素处理）→无菌落说明：（1）细菌接合中遗传物质的转移是单向的。（2）菌株A和菌株B虽然来自同一野生型菌株K12，但在杂交中显然起着不同的作用，菌株A相当于雄性，是遗传物质的供体（donor），而菌株B相当于雌性，是遗传物质的受体（receptor）。大肠杆菌中供体和受体菌株的区别就在于它们是否有一种微小的质粒——F因子。F因子（Ffactor或Felement）又称性因子（sexfactor）或致育因子（fertilityfactor）。它是一种封闭的环状DNA分子，相对分子质量约为4.5×106，全长约为9×104bp，大约为大肠杆菌环状染色体全长的2%，以游离状态存在于细胞质中。F因子的三种状态：（1）没有F因子，即F－；（2）一个自主状态F因子，即F＋；（3）一个整合到自己染色体内的F因子，即Hfr。F+×F-杂交Hfr×F-杂交三、细菌重组的特点因此，在细菌的重组中有下列两个特点：（a）只有偶数次交换才能产生平衡的重组子。（b）不出现相反的重组子，所以在选择培养基上只出现一种重组子。第四节中断杂交与重组作图1954年Wollman和Jacob大肠杆菌：Hfr：azirtonrlac＋gal＋strsF-：azistonslac-gal-strr一、中断杂交实验原理链霉素敏感二、中断杂交作图0510152025(分钟)起点thr,leuazitonlacgal图8-13利用中断杂交进行E.coli染色体作图几个Hfr菌株的基因顺序菌株基因转移顺序HfrH0thrprolacpurgalhisglythi10thrthiglyhisgalpurlacpro20prothrthiglyhisgalpurlac30purlacprothrthiglyhisgalAB3120thithrprolacpurgalhisgly1960，J.Cairns利用电子显微镜观察到大肠杆菌的DNA确实是环状。大肠杆菌的环状基因图有四株大肠杆菌分别为1、2、3、4，它们的基因型为a+b，另外四株分别为5、6、7、8，基因型为ab+。将基因型不同的菌株两两混合培养，在基本培养基上测定重组子a+b+出现情况如下表。写出每一个菌株的性别（F+、F-、Hfr）。（表中O代表无重组体，M代表有重组体，L代表有大量重组体）56781OMMO2OMMO3LOOM4OLLO56781OMMO2OMMO3LOOM4OLLO■细菌的遗传物质的转移是单方向性，即只能从Hfr或F+转向F-。■Hfr×F-有大量重组体，F+×F-有少量重组体，其他的接合没有重组体。1.F+2.F+3.F-4.Hfr5.Hfr6.F-7.F-8.F+第五节F′因子与性导HfrF＋一、F′因子1959年，Adelberg和Burns发现：整合到细菌染色体上的F因子，在环出时不够准确，携带出细菌染色体上的一些基因，这种带有染色体基因的附加体称为F′因子（F′factor）F′因子携带染色体的节段大小：从一个标准基因到半个细菌染色体。二、性导利用F′因子将供体细胞的基因导入受体细胞的过程称作性导（sexduction）。F′因子F+、F-、Hfr、F′之间的关系：F+F-HfrF′整合整合丢失丢失获得脱离脱离第六节转化与转导作图一、转化1.转化的发现肺炎双球菌转化实验1927F.Griffith（格里菲思）肺炎链球菌的转化实验为了证明遗传物质是DNA，但没有进行单因子转化实验。1944O.T.Avery进行单因子转化实验证明DNA是遗传物质。2.转化的定义细菌细胞（或其他生物）将周围的供体DNA摄入到体内，并整合到自己染色体组上的过程称为转化（transformation）。显然，转化就是细菌细胞摄取周围游离的外源DNA片段，通过同源区段的交换而实现基因重组的过程。所以转化也是细菌传递DNA而实现基因重组的途径之一。通常从一个供体菌株分离出来的DNA与另一受体菌株活细胞接触，大约只有1％的受体细菌细胞可吸收外源DNA，并发生遗传转化。转化频率低的原因可能是：■受体细菌细胞壁并非任何区域都允许外源DNA片段通过，而只是在特定区域形成临时性通道，因此将这一区域称为受体部位，而在受体细胞表面这一部位的数目是有限的。■外源DNA进入除受体部位允许通过外，还必须有酶或蛋白质分子以及能量等的协同作用。解决方法：(1)一般要对受体细胞进行处理：化学处理或用强电场处理（electroporation，电穿孔）。目的：是增加受体细胞膜对供体DNA的可透性。(2)制备感受态细胞（competentrecipientcell）：能吸取DNA分子而被转化的细菌细胞叫做感受态细胞。在某一细菌群体中，只有极少数细胞是感受态的，它们具有感受因子（comptencefactor），可能是细胞表面的一种蛋白质或是一种转化酶（translocase），它参与DNA的吸收。3.转化的过程4.转化作图在转化过程中，DNA小片段→受体。■相距很远的二个基因很难同时存在于一个DNA片段中，一般不能同时进行转化。■两个基因紧密连锁时，它们就有较多的机会包括在同一个DNA片段中，并同时整合到受体染色体里——共转化（cotransformation），共转化的基因一般是连锁的。一个菌株的基因型为ACNRX，但基因的顺序不知道。用它的DNA去转化一个基因型为acnrx的菌株，发现下列的基因型：AcnRx、acNrX、aCnRx以及AcnrX，还有一些仅有单个基因被转化的菌株（如aCnrx）。问ACNRX基因的顺序如何？基因的顺序为：CRAXN二、转导1.转导现象的发现为了验证在沙门氏菌（Samlonellatyphmiurium）中是否也存在类似于大肠杆菌中的接合现象，J.Lederberg和N.Zinder进行了下列杂交试验：LT22phe-trp-tyr-his+×LT2phe+trp+tyr+his-结果发现：在基本培养基上以10-5频率出现野生型菌株。但是当他们将两个亲本菌株分别置于“U”型管的两臂时，出乎意外地在LT22的一臂也出现了野生型细菌。进一步实验证明在两个菌株之间传递遗传物质的因子是沙门氏菌中的一种温和噬菌体P22。因为：（1）滤板孔径允许通过的这种因子的大小和质量与P22相同。（2）免疫学试验证实这种因子可以被P22抗血清灭活。（3）如用抗P22的LT2菌株来代替敏感的LT2，那么在“U”型管两端都不出现野生型重组体。（4）进一步研究也证明LT22是携带了P22原噬菌体的溶源性细菌，LT2是对P22敏感的非溶源性细菌。转导（transduction）就是以病毒作为载体将遗传信息从一个细菌细胞传递到另一个细菌细胞。转导颗粒：把细菌染色体片段包装在噬菌体蛋白质外壳内而产生的假噬菌体，其中并不包含噬菌体的遗传物质。转导普遍性转导局限性转导2.普遍性转导与作图普遍性转导（generaltransduclion）：能够转导细菌染色体上的任何基因。如：P1和P22这类噬菌体所进行的转导。两个基因同时转导的现象称为共转导（cotransduction），两个基因共转导频率愈高，表明两个基因连锁愈紧密，相反，共转导频率愈低，则表明这两个基因距离愈远。1966年，T.TWu(HarvardUniversity)共转导频率与图距的关系式:d—同一染色体上两个基因之间的图距L—转导DNA的平均长度（约为一个噬菌体基因组大小）x—两个基因共转导的频率X=（1-d/L）3P1是普遍性转导常见的噬菌体，其头部可以包裹高达91.5kb的供体DNA，如果标记基因之间两两相距分别为60kb、30kb和10kb，则以P1为媒介的并发转导的预期频率分别为4%、30%和70%。细菌基因的平均大小为1kb，则紧密连锁的2个基因发生并发转导的概率为97%。X=（1-d/L）3例：用E.colitrpA+supC+pyrF+供体细胞和trpA-supC-pyrF-作为受体由P1噬菌体媒介转导进行三因子转导杂交实验结果：转导型数目1.supC+trpA+pyrF+362.supC+trpA+pyrF-1143.supC+trpA-pyrF+04.supC+trpA-pyrF-453总计：603问：它们的基因顺序？共转导频率？解：上述三个基因在遗传图上的顺序可以从第3种转导型上立即判断出来，因为它的数目最少（等于0）。三个基因的次序：supCtrpApyrFsupC+和trpA+二基因共转导形成第1和第2两种转导型，因此，supC—trpA的共转导频率是：36+114/603=0.25同理：supC—pyrF的共转导频率是：36/603＝0.06三基因在遗传图上顺序和间隔距离是：普遍性转导中，在基本培养基上除了出现正常菌落外，还有大量小菌落，这两者之比大约1:10，这一现象称为流产转导（abortivetransduction）。流产转导（abortivetransduction）：转导的DNA不整合到受体细胞的染色体上，虽然不能继续复制，但仍能表达基因的功能的转导，最终将随细胞分裂而丢失，也可能出现单线遗传。3.局限性转导与作图局限性转导（restrictedtransduction）：由温和噬菌体（λ）进行的转导，可被转导的只是λ噬菌体在细菌染色体上插入位点两侧的基因。本章小结1.重要概念F因子、F′因子、接合、转化、性导、转导、普遍性转导、局限性转导、流产转导、F+菌株、F-菌株、Hfr菌株、F′菌株、中断杂交实验等。2.大肠杆菌的性别3.中断杂交与重组作图4.F′因子与性导5.转化与转导