85蛋白质工程

蛋白质工程生物技术系李刚第一讲蛋白质工程概况一、蛋白质工程的含义1983年由Ulmer首先提出“蛋白质工程”的概念，是生物工程的重要组成部分。蛋白质工程：以蛋白质分子的结构功能的关系研究为基础，利用基因工程技术，按照人类自身的需要，定向改造天然蛋白质，甚至创造新的、自然界本不存在的、具有优良特性的蛋白质分子的现代生物技术。即：按照特定的需要，对蛋白质进行分子设计和改造，并表达出具有不同功能的蛋白质。通过改造与蛋白质相应的基因中的碱基顺序，或设计合成新的基因，将它克隆至受体细胞中，通过基因表达获得具有新的特性的蛋白质技术。这是一门从改变基因入手，定做新蛋白质的技术，是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程。通过蛋白质化学、蛋白质晶体学和动力学的研究，获取有关蛋白质理化、结构、功能等各方面的信息，在此基础上利用生物技术手段对蛋白质的DNA编码序列进行有目的设计改造，获取自然界没有的、具有优良性质或适用于工业生产条件的全新蛋白质的过程，是包含多学科的综合科技工程。目标：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分子设计与改造，定向改造或制造蛋白质。特征：在基因水平上特异地做一个非天然的优良工程蛋白。实质：对编码蛋白质的基因进行改造。前提：了解蛋白质的结构、功能及理化性质等原理：基因修饰或基因合成设计理念分子定向进化分子理性设计以蛋白质的性质、结构和功能的信息及其相互关系为基础，包括活性设计、专一性设计、构象设计等以体外模拟自然进化为基础，基因修饰和改造实施的必要条件筛选系统（灵敏、准确、高通量）随机突变库的构建（快速、简便、高效）根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新蛋白质。确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系（核心）；二、蛋白质工程的主要研究内容蛋白质工程研究的4大主要类型利用已知蛋白质的一级结构信息开展应用研发；定量确定蛋白质结构-功能关系：这是目前蛋白质工程研究的主体，包括蛋白质三维结构模型的建立，酶催化的性质、蛋白质折叠和稳定性研究等；从混杂变异体库中筛选具有特定结构-功能关系的蛋白质；根据已知结构-功能关系的蛋白质，用人工方法合成它及其变异体。三、蛋白质工程的原理中心法则基因DNA多肽链三维结构的蛋白质生物功能mRNA转录翻译折叠蛋白质工程的理论依据：基因指导蛋白质的合成。基因DNA推测多肽链的氨基酸序列设计预期蛋白质的三维结构预期蛋白质的功能分子设计DNA合成蛋白质工程：反向生物学蛋白质工程设计原理蛋白质工程设计（蛋白质分子设计）：在知道需要改造的蛋白质的结构和功能的基础上，通过理论的方法，提出蛋白质改造的设计方案。为蛋白质工程提供指导性信息，也为探索蛋白质的折叠机制提供重要方法。基因水平的改造：改造蛋白质的编码基因蛋白质水平的改造：蛋白质的加工与修饰分子设计的层次四、蛋白质工程的程序与操作方法蛋白质工程的程序从生物体中分离纯化目的蛋白；测定其氨基酸序列；借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能多地了解其空间结构信息；对目的蛋白的功能作详尽的研究，确定它的功能域*；通过分析蛋白质的一级结构、空间结构和功能之间相互关系，找出关键的基团和结构*；围绕这些关键的基团和结构提出对蛋白质进行改造的方案，并用基因工程的方法去实施；对经过改造的蛋白质进行功能性测定，看看改造的效果如何；重复上述带*的两步，直到获得比较理想的结果；分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。纯蛋白质基因文库空间结构模型蛋白质与功能研究合成的寡核苷酸计算机辅助设计分子性质预测及分子定向改造方案测试分子性质纯化的突变体蛋白质表达载体DNA序列突变体克隆化基因蛋白质工程的程序蛋白质工程的操作方法合理化的分子设计基因的定向突变和定向进化突变体的大规模筛选突变体的表达及其分析检测通过改变蛋白质的活性部位，提高其生物功效；通过改变蛋白质的组成和空间结构，提高其在特定(极端)条件下的稳定性；通过改变蛋白质的遗传信息，提高其独立工作能力，不再需要辅助因子；通过改变蛋白质的特性，使其便于分离纯化；通过改变蛋白质的调控位点，使其与抑制剂脱离，解除反馈抑制作用；........五、蛋白质工程的技术策略六、蛋白质工程的诞生与发展蛋白质工程是20世纪80年代初诞生的一个新兴生物技术领域。1983年，Ulmer在“Science”上发表以“ProteinEngineering”(蛋白质工程)为题的专论，一般将此视为蛋白质工程诞生的标志。1984年，Perry通过将溶菌酶中Ile(3)改成Cys(3)，并进一步氧化生成Cys(3)-Cys（97）二硫键，使酶热稳定性提高，显著改进了这种食品工业用酶的应用价值。1987年，福什特通过将枯草杆菌蛋白酶分子表面的Asp99和Glu156改成Lys，而导致了活性中心His64质子pKa从7下降到6，使酶在pH6时的活力提高10倍。1988年杜邦公司宣布，成功设计并合成了由四段反平行α-螺旋组成含73个氨基酸残基的成果。这显示，按人们预期要求，通过从头设计以折叠成新蛋白的目标已是可望又可及了。由此蛋白质工程开创了按照人类意愿改造、创造符合人类需要的蛋白质的新时期。第二讲蛋白质的结构基础蛋白质是由许多氨基酸单位通过肽键连接起来的、具有特定分子结构的高分子化合物。蛋白质分子的生物功能，与蛋白质分子的结构密不可分。蛋白质分子的构象是其功能活性的基础，是决定这种特殊生物功能的关键因素。蛋白质的分子结构可人为划分为一、二、三、四级结构。除一级结构外，蛋白质的二、三、四级结构均属于空间结构。一、蛋白质的结构层次蛋白质的结构层次四级结构三级结构结构域超二级结构二级结构一级结构核糖核酸酶：124aa，分子内含有4个二硫键蛋白质的一级结构（氨基酸序列）决定它的高级结构，是阐明蛋白质生物功能的分子基础。IAYKPAG。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。氨基酸序列（一级结构）高级结构生物功能二级结构：蛋白质主链折叠产生的有规则构象，主要有-螺旋、-折叠片、-转角和无规卷曲等。结构复杂的蛋白质分子就由这些比较简单的二级结构元件进一步组合而成。超二级结构（super-secondarystruture，结构模体struturemotif）：相邻的二级结构元件组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的在空间上能辨认的二级结构组合或二级结构串，其充当三级结构的构件。常见的超二级结构αα（复绕α-螺旋）βαβββ（β曲折和希腊钥匙拓扑结构）β-折叠桶α-螺旋-β转角-α-螺旋结构域（domain）：多肽链在二级结构及超二级结构的基础上，进一步卷曲折叠成的相对独立的紧密球状结构，即它们按一定的拓扑学规则构成的三维空间结构实体。通常是几个(超)二级结构的组合；结构域自身是紧密装配的，但结构域与结构域之间关系松懈；对于较小的蛋白质分子，结构域与三级结构等同，即这些蛋白为单结构域蛋白；较大的蛋白质分子或亚基往往由两个以上结构域缔合而成三级结构；结构域是球状蛋白质的折叠单位。结构域与功能域的关系：有时一个结构域就是蛋白质的功能域，但不总是；功能域通常由多个结构域组成；作为酶活性部位的功能域常由多个结构域的相邻部分组成，结构域的剩余部分不参与组成活性部位。结构域的类型反平行螺旋结构域混合型折叠结构域（结构域）反平行折叠片结构域富含金属或二硫键结构域蛋白质的三级结构：蛋白质分子在二级结构或超二级结构基础上进一步盘曲折叠而形成的整体构象，即一条多肽链全部原子在三维空间的排布位置。溶菌酶分子的三级结构三级结构是蛋白质发挥生物活性所必须的；球状蛋白的三级结构很密实，大部分的水分子从球状蛋白的核心中被排出，这使得极性基团间以及非极性基团间的相互作用成为可能。蛋白质的四级结构：专指亚基的种类、数量以及各个亚基在寡聚蛋白质中的空间排布和亚基间的相互作用。血红蛋白的四级结构由两个α亚基和两个β亚基构成一个四面体构型，每个亚基分别含1个血红素辅基。亚基单独存在时无生物活性或活性很低，只有相互聚合成特定构象时才具有完整的生物活性；一级结构规定了亚基间的结合方式，四级结构的形成遵从“自我装配”的原则。二、蛋白质结构分类复杂性和多样性是蛋白质结构的重要特征，（超）二级结构的组合构成了大多数结构域结构的核心。在结构域中，结构模体的组织方式是有限的，而且一些组合具有明显的优势，常常出现在功能和序列都不相同的蛋白质中，使蛋白质的结构域表现出一些主要的类型。分类M.Levitt和C.Chothia的分类法：认为二级结构的组合构成了大多数结构域结构的核心，在结构域水平上，蛋白质的结构分为：α型结构、β型结构、α/β型结构、α+β型结构、无规型／富含二硫键和金属离子型。20世纪70年代，建立了蛋白质结构数据库（ProteinDataBank，PDB），PDB数据库最初由美国Brookhaven国家实验室负责维护和管理，为适应结构基因组和生物信息学研究的需要，1998年，由美国国家科学基金委员会、能源部和卫生研究院资助，成立了结构生物学合作研究协会(ResearchCollaboratoryforStructuralBioinformatics，RCSB)，并由RCSB对PDB进行维护和管理。系统性分类蛋白质结构分类是蛋白质结构研究的一个重要方向，包括如折叠类型、拓扑结构、家族、超家族、结构域、二级结构、超二级结构等不同层次。蛋白质结构分类数据库是三维结构数据库（PDB）的重要组成部分。蛋白质结构分类数据库SCOP（StructuralClassificationOfProteins）：由英国医学研究委员会（MedicalResearchCouncil，MRC）的分子生物学实验室和蛋白质工程研究中心开发和维护。该数据库对已知三维结构的蛋白质进行分类，并描述了它们之间的结构和进化关系。SCOP数据库从不同层次对蛋白质结构进行分类，以反映它们结构和进化的相关性。通常将蛋白质分成家族，超家族和折叠类型等许多层次，但不同层次之间的界限并不十分严格，通常层次越高，越能清晰地反映结构的相似性。家族：为SCOP数据库的第一个分类层次，依据的是序列相似性程度。通常将相似性程度在30%以上的蛋白质归入同一家族，即它们之间有比较明确的进化关系。当然这一指标也并非绝对，某些情况下，尽管序列的相似性低于这一标准，也可以从结构和功能相似性推断它们来自共同祖先（如：某些球蛋白家族的序列相似性只有15%）。超家族：如果序列相似性较低，但其结构和功能特性表明它们有共同的进化起源，则将其视作超家族。折叠类型：无论有无共同的进化起源，只要二级结构单元具有相同的排列和拓扑结构，即认为这些蛋白质具有相同的折叠方式。在这些情况下，结构的相似性主要依赖于二级结构单元的排列方式或拓扑结构。CATH蛋白质结构分类数据库：它由英国伦敦大学UCL开发和维护，其含义为类型（Class）、构架（Architecture）、拓扑结构（Topology）和同源性（Homology）。CATH数据库的分类基础是蛋白质结构域。第一个层次为二级结构的类型：蛋白质分为α主类、β主类，α-β类（α/β型和α+β型）和低二级结构类（二级结构成分含量很低的蛋白质分子）4类。第二个层次为超二级结构的排列方式：不考虑它们之间的连接关系，形象地说来就是蛋白质分子的构架，如同建筑物的立柱、横梁等主要部件。第三个层次为拓扑结构：二级结构的形状和二级结构间的联系。第四个层次为结构的同源性：先通过序列比较后再用结构比较来确定。最后一个层次为序列的同源性：在这一层次上，只要结构域中的序列同源性大于35%，就被认为具有高度的结构和功能的相似性。对于较大的结构域，则至少要有60%与小的结构域