镜检实验室技术.ppt

疟疾镜检实验室技术太和县疾病预防控制中心2012.5.20血片制作、染色所需器材1.载玻片：玻片使用前应清洗干净，以防血膜脱落。①新玻片应先浸入有液态洗涤剂的清水中10~20分钟，然后用干净棉巾逐个擦拭，再用清水冲洗干净，凉干，最后用干净、柔软的棉巾将玻片擦亮。②已用过的玻片应先浸泡于洗涤剂溶液中1~2天，或浸泡于煮沸的5％肥皂水中1~2小时，再移到新配置的洗涤剂溶液中1~2小时，逐个擦去玻片上旧的血膜痕迹，用清水漂洗干净，再将玻片擦干擦亮。洗净的玻片每10~20张用白纸包好放入塑料袋内，保存于干燥环境中备用。血片制作所需器材2.采血针：使用一次性釆血针。3.75％乙醇棉球：用于采血前后的消毒。4.记号笔：用于玻片上书写号码。5.玻片盒：防止污染和蝇、虫吸食血膜。6.无水甲醇：固定薄血膜。7.二甲苯或无水乙醇3份与乙醚7份的混合液：用于血片和镜头脱油。8.姬氏或瑞氏染液采血部位及取血方法以耳垂采血较为合适，也可采手指末端血，婴儿可从拇趾或足跟取血。。用75%酒精棉球消毒采血部位，待酒精干后，左手拇指和食指紧捏采血部位两侧，右手持一次性采血针迅速刺入1－2毫米深，轻轻挤出血滴，涂制血膜。采血的血量涂制厚血膜：血量约为4－5μl(如小火柴头大小血量)，涂成直径约0.8—1.0cm圆形厚血膜。血膜厚度以1个油镜视野可见5－10个白细胞为宜。涂制薄血膜血量：只需血液1~1.5μl，约厚血膜的1/3-1/4血量），薄血膜涂成宽约2cm，长约2.5cm的舌状血膜。厚、薄血膜的形状和位置厚血膜的位置，位于玻片右1/3处。薄血膜宽2cm，长2.5cm.厚血膜外观：圆形厚薄均匀，无划痕。过厚易于脱落，过薄达不到检出率的要求。薄血膜位置：位于玻片1/2～1/3处。薄血膜外观：舌状厚薄均匀，无划痕。呈轻微黄白色，可看到书报字体。厚、薄血膜的大小位置每张载玻片上可做1个薄血膜和1个厚血膜，如图厚薄血膜的位置标准的疟疾厚薄血膜片位置厚血膜涂制方法取洁净玻片2张，1张做载片，1张做推片，推片边缘要光滑，载玻片放桌上，右手拇指和食指持推片二侧，以推片左端下角刮取1小滴血(小火柴头大小），在载玻片1/3处，涂成直径0.8－1.0厘米厚血膜。涂毕后用干棉球擦净耳垂上和推片上残留血渍。薄血膜涂制方法以推片左端中部刮取1－1.5ul血液，然后将血液端推片平抵载玻片，略加实压，使血液向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持25°一35°角，从右向左迅速推成薄血膜。推时速度快慢、血滴大小和角度均影响血膜的厚薄程度。最理想的薄血膜是一层血细胞，血细胞的分布排列比较均匀。无裂缝，无空隙。正确的推片姿势血片的编号待血膜自然干燥后，用铅笔将受检者号码写在薄血膜上，这样号码不易脱落。血片编号也可根据实际需要进行操作。血片的固定与厚膜溶血薄血膜先用无水甲醇或无水乙醇固定，厚血膜不能固定，即不能接触甲醇或酒精。厚血膜可以直接用吉氏染色，不需要先溶血。但瑞氏染色，厚血膜一定要先溶血再染色未处理血膜放置时间夏天一般不易超过48小时，冬天不易超过72小时，否则厚血膜会自然固定而不能溶血，影响镜检。不能及时染色的血膜，可先用甲醇固定薄血膜，将厚血膜溶血，晾干后包好，放入干燥器中，置于冰箱内保存。临用时，将干燥器放置室温中1~2小时后取出血片。间日疟－采血的时间间日疟什么时间检查,都能查到疟原虫，但在发作数小时至十余小时后，疟原虫发育到大滋养体或裂殖体时更以查到。在患者发热初期，查血往往可看到较多环状体、裂殖体，也可见到大滋养体和配子体。间日疟原虫在患者刚发冷发热后不久，大部是在小滋养体期，即环状体期，故这一时期可能区别疟原虫种类是不太容易的。恶性疟－采血的时间外周血恶性疟原虫可见到的环状体和配子体。环状体在外周血液中经10几个小时的发育后，逐渐隐匿于微血管、血窦等内脏的毛细血管内，继续发育成大滋养体及裂殖体，所以，这两个时期在外周血液中一般不易见到。故较理想的取血时间，是在发作后的10－15小时。因为这个时候，环状滋养体发育到最高峰，但尚进入内脏毛细血管中发育。恶性疟环状体的数量与构造，有助于疟原虫种类的鉴别。恶性疟原虫的配子体很易识别，但在初发时，一般需要在发作7－10日后才能在末稍血液中出现，应当注意。染色剂的选择疟原虫镜检常用的染色方法有吉氏染色和瑞氏染色，推荐使用吉氏染液。①吉氏染剂较适用于厚血膜和批量血膜的染色；②染色效果稳定，吉氏染色后的血膜保存时间较长，疟原虫不宜退色。③吉氏染剂能长期保存而不变质。④染色技术易掌握。染色方法固定薄血膜：要用甲醇或无水乙醇；瑞氏染色前厚血膜要溶血：用蒸馏水或清水溶血。吉氏染色液的配制：取蒸馏水或缓冲液8ml加入吉氏染原液10~12滴，配成3%的稀释液，混合均匀后，滴在厚、薄血膜上，染色20~30分钟，然后水洗、晾干。吉氏稀释液使用时间：最好0.5－1小时内使用染色效果最好；使用最长时间不超过1天。8ml染色用水染液稀释用水和冲洗用水常用中性的蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水，也可用井水、河水、泉水或雨水。为了使血膜着色较好，应用pH7.0～7.2水效果最佳。影响染色效果的因素血片染色好坏除与玻片是否清洁，血片制作质量好坏有关外，还与下列因素有关:1、染料和溶剂的质量2、染液的新旧3、染液稀释后的使用时间影响染色效果的因素4、染液的稀释浓度。5、染色时间：根据染液质量、新旧、浓度和气温6、染色用水PH7.0—7.27、冲洗血片时不能直接将染液倒掉染色质量质量好的染色:核呈红色,胞浆呈蓝色。红细胞呈淡红色或紫红色；嗜酸性细胞的颗粒呈鲜红色;淋巴细胞胞浆呈兰色或淡兰色;白细胞和淋巴细胞的核呈紫蓝色;如果血片偏红，说明染液偏酸性。如果血片偏蓝，说明染液偏碱性。血片制作的注意事项1.刚涂制的血膜要平放，注意防尘、防虫。2.血膜应自然干燥。切忌在毒太阳下晒或火烤，干透后才能用甲醇固定薄血膜。加热会使原虫变形，影响镜检结果。3使用前载玻片一定要清洁，不然会影响血片制作和镜检结果。4.配置母液时过滤可除去杂质颗粒，有助于提高镜检质量。5.固定薄血膜时不要将甲醇触碰到厚血膜。6.冲洗染液时，不要冲走厚血膜。疟原虫血片制作质量考核评分表项目检查内容评分标准检测结果分值检测结果分值检测结果分值血片制作厚血膜（25分）血量（5分）4～5mm3（μl）5略多或略少3过多或过少1位置（5分）玻片右1/35稍偏右4偏右过多3直径（5分）0.8～1.0cm50.7～0.8或1.0～1.2cm30.7或1.2cm1外观（10分）圆形厚膜均匀，边缘整齐10圆形稍不均不整齐8厚薄不匀影响着色5薄血膜（25分）血量（5分）1～1.5mm3（μl）5略多或略少3过多或过少1位置（5分）玻片1/2～1/3处5稍偏右或偏左4偏右或偏左过多3直径（5分）2.5～2.0cm5稍大或稍小3过多或过少1外观（10分）舌状厚薄均匀10舌状稍不均5厚薄不匀呈波浪型3血片染色质量（30分）外观（10分）蓝紫色10深蓝色6红色或灰白色4镜下（20分）白细胞、疟原虫胞浆蓝色，核红色20染色过深，原虫胞浆与核均呈深蓝色16染色过浅，胞浆蓝色不易显见，核淡红10血片清洁度（20分）外观（10分）光洁无油灰10稍有油污6油灰粘连4镜下（10分）无沉渣10稍有沉渣6沉渣多或有杂菌41.涂制厚血膜2.推制薄血膜3.固定薄血膜4.厚血膜溶血5.稀释染液及染色6.漂洗7.镜检谢谢大家！