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兽医生物制品学第一篇总论第一章生物制品概述一、生物制品与生物制品学（一）生物制品的概念（biologics）利用微生物、寄生虫及其组分或代谢产物或免疫应答产物制备的一类物质，用于传染病或其他有关疾病的预防、诊断和治疗的生物制剂。兽医生物制品（Veterinarybiologics）：用于动物免疫预防、诊断和治疗的生物制品生物制品：疫苗、免疫血清、诊断制剂WHO定义：效价或安全性检定仅凭物理化学的方法或技术不足以解决问题而必须采用生物学方法检定的制品（二）生物制品学的概念与内容1、概念：生物制品学是在微生物学、免疫学和传染病学的基础上，采用生物学、生物化学及生物工程学等技术和方法，研究和制备生物制品，用以解决人、畜疾病防治的新兴应用科学。2、内容：（1）生物制品的生物学根据微生物学和免疫学原理，重点研究生物制品本身的特性及与动物机体的关系、安全性、有效性，研究其在传染病的免疫诊断、治疗和预防中的应用原理、方法和意义。（2）生物制品的工艺学，以生物化学、细胞学、遗传学、制冷学以及生物工程学技术的原理，保证优良制品、提高质量。我国生物制品学面临的问题:(1)改造工艺,提高传统产品质量.(2)研制新发疾病生物制品(3)现有诊断试剂的标准化和研究新的诊断试剂(4)免疫增强剂的研制和运用(5)新型疫苗的研究二、生物制品的分类（一）疫苗:由病原微生物、寄生虫及其组分或代谢产物所制成的、用于人工自动免疫的生物制品。1.常规疫苗：由细菌、病毒、立克次氏体、螺旋体、支原体等完整微生物制成的疫苗。（1）灭活苗（死苗）一般灭活苗：菌、毒种经大量培养后，灭活而成。脏器灭活苗:利用病、死动物的含病原微生物脏器制成自家灭活苗：从病、死动物分离培养病原体大量培养制成的灭活苗（2）活苗(弱毒苗)主要指弱毒活疫苗，人工诱变获得的弱毒株或筛选的天然弱毒株或者失去毒力的无毒株所制成的同源疫苗（homologousvaccines）用所要预防的病原体制成。异源疫苗(heterogenousvaccines)：火鸡疱疹病毒疫苗、鸽痘病毒、麻疹苗（3）类毒素：细菌的外毒素，用适当浓度（0.3—0.4%）的甲醛溶液脱毒而成的生物制品。经盐析、浓缩制成精制类毒素。（4）生态制剂（ecologicalpreparation）或生态疫苗（ecoligicalvaccines）微生态平衡：动物机体内有重要的正常微生物体系，对机体健康有重要的维持作用，平衡破坏则引起疾病。定植抗力（colonizationresistance）：正常菌群所提供的对感染的保护作用。微生态制剂：由正常微生物所制成的生物制品有双岐杆菌、乳酸菌、蜡样芽胞杆菌和枯草杆菌（5）寄生虫疫苗：A..寄生虫病的危害，慢性，不易察觉但损失严重B.复杂的生活史、抗原复杂、高度多变C.网尾线虫疫苗、球虫疫苗（6）瘤苗：以手术或活体检查取出的肿瘤组织，经射线、抗癌药物或甲醛处理灭活后所制成的疫苗。注：有严重的副作用—产生较多的封闭因子，否定？2.亚单位苗（subunitsvaccines）利用微生物的一种或几种亚单位或亚结构制成的疫苗降低副作用，安全性好结核杆菌核糖体、脑膜炎球菌的荚膜多糖、肺炎球菌苗的多糖成分、A族链球菌M蛋白、大肠杆菌菌毛疫苗（1）基因工程苗：利用基因工程技术，取出微生物中编码保护性抗原肽段的基因，再将此基因与质粒等载体重组，导入受体菌或细胞，使之在受体菌或细胞内高效表达，产生大量保护性肽段，加佐剂制成。尚未能实际应用：高效表达？稳定？外源蛋白的分泌问题糖基化？死苗、工艺复杂、成本高基因工程活载体苗（重组活毒疫苗）：通常以痘苗病毒、疱疹病毒为载体，将目的基因插入此种病毒基因组的特定位置（如TK基因上），使载体病毒获得表达外源基因的新的特性载体有痘病毒、疱疹病毒、腺病毒、反转录病毒基因缺失苗：利用基因工程技术切去病毒基因组编码致病物质的某一段核苷酸序列，使该微生物致病力丧失，但仍保持免疫原性及复制能力。目前最成功的疫苗：PRV基因缺失苗。（2）合成肽苗（syntheticpeptidevaccines）：按照病原微生物保护性抗原决定簇的氨基酸序列，人工合成含有保护性抗原决定簇的短肽并连接于载体蛋白上所制成的疫苗Shinnick等已将口蹄疫A，O，C三种血清型的141-160位氨基酸的合成肽连在同一载体蛋白上。优势：①不引发疾病、无毒力②不会出现遗传变异③不需低温保存④可制成多价、多联苗缺点：免疫原性差，需要加佐剂，成本高去势多肽疫苗：ARIMURA（1973）用促黄体释放激素（LHRH）免疫雄兔，LHRH功能丧失，导致LH（垂体的促黄体激素）的合成分泌受抑制。可导致雄性动物不育。1990南农刘公平、杜念兴等LHRH+BSA（牛血清蛋白）。促动物生长的合成肽苗：生长抑制激素（14肽）+载体（3）抗独特型疫苗：BURNET—抗体形成的克隆学说JERNE（1974）—免疫调节网络学说独特型（idiotype）Id，抗独特型（anti-Id）1981年Nisonoff提出设想,用AB2免疫动物，必然产生AB3。AB3和AB1一样能中和感染因子，用ＡＢ２作为抗独特型疫苗，可以激发对相应病原体的免疫力．（二）免疫血清（immuneserum）高免血清、抗血清、抗病血清。动物经反复多次注射同抗原后，血清中产生大量抗此种抗原的抗体，采集血液分离的血清制成，产生免疫力快,但持续期短。抗小鹅瘟免疫血清、犬瘟热抗血清，破伤风抗毒素、人的白喉抗毒素、蛇毒抗毒素、肉毒抗毒素。（三）诊断液（诊断制剂）利用微生物、寄生虫及其代谢产物，或者含有特异性抗体的血清制成的，供诊断动物传染病及寄生虫或检查动物免疫状态以及鉴定病原微生物的生物制品。诊断抗原：变态反应性抗原:纯蛋白衍生物结核菌素（PPD）、布氏杆菌水解素。血清反应性抗原：布氏、炭疽、鸡白痢等。3.诊断血清：多用抗原免疫羊、兔或其他动物制成因子血清（分型血清）：用具有类属抗原的其他微生物将免疫血清中的共同抗体吸收掉，仅留下一种或部分特异性抗体。标记抗体：有荧光抗体、酶标抗体、同位素标记抗体、生物素亲和素标记抗体（四）其他生物制品1、非特异性免疫活性因子：白细胞介素、干扰素、转移因子、胸腺因子以及其他免疫增强剂。2、血液制品：血浆、白蛋白、丙种球蛋白、纤维蛋白原、胎盘球蛋白三、生物制品的命名动物种名+病名+制品种类个别用人名如卡介苗猪瘟-猪丹毒-猪肺疫三联活疫苗、猪伪狂犬病乳胶凝集抗原狂犬病抗血清第二节….生物制品发展简史我国宋朝创造了“吹花”，用人痘预防天花生物制品的初始阶段1721年人痘法传入英国1796年英国医生爱德华.秦纳牛痘苗—最早的疫苗1881年，免疫学创始人之一，法国的LouisPasteur禽霍乱、炭疽杆菌，1885年狂犬病疫苗1902年Haffkine霍乱减毒活疫苗1906年Bang动物用牛流产布氏杆菌苗1921年CalmetleandGuerin卡介苗1884----1886Salmon和Smith霍乱死苗1890VonbehringandKitasaton抗白喉、破伤风抗毒素1894ACalmetle抗蛇毒血清1891RobertKoch结核菌素第三节制造生物制品的条件一、基本条件1、相应的厂房和动物舍2、相应的生产设备3、一定比例的专业技术人员，包括能掌握生产技术和实验技术的专业人员。4、具有防止散毒的设施和隔离条件，具有良好的卫生环境。5、具有良好的消毒和排污设施6、水、电供应7、具有稳定的合乎标准要求的菌毒种（1）合格的实验动物及细菌、病毒的培养基质（2）国家有关部门批准取得生产许可证。二、生物制品生产的申报与审批1、实验室实验2、田间实验3、中间实验4、区域实验5、申报6、审批7、新制品试生产8、申请转为正式生产9、经兽药评审委员会再评价后，建设列入规程的，发给正式生产批准文号第四节我国兽医生物制品事业的概况与成就★1951年，成立了兽医生物制品监察所（1982年改名中国兽药监察所）。★猪瘟兔化弱毒苗属世界领先地位，★马传贫弱毒苗、牛瘟疫苗、鸭瘟疫苗、小鹅瘟疫苗、仔猪副伤寒苗属国际水平。★与发达国家相比仍有许多不足。一、生物制品菌、毒种的概念与分类凡应用于生物制品生产、鉴定和研究的细菌菌种、病毒毒种以及分类地位在原虫以下的生物种都属于生物制品的菌种和毒种范围。按用途分类：1、生产用菌、毒种，A、直接生产用B、免疫用C、加工用2、鉴定用菌、毒种，4、标准菌株（参考菌株）第二章生物制品的菌种与毒种二、生物制品菌毒种的一般要求1、来源（历史）清楚，资料完整由中监所或中监所委托分管的单位负责供应2、生物学特性比较典型菌、毒种的形态特征，培养特性，对动物的病原性特点，引起细胞病变的特征生物化学、免疫学及血清学特性3、血清型相符与疫苗使用区的流行病原相符4、遗传性状稳定保存、传代、使用过程中受各种因素影响容易变异三、菌种鉴定（一）毒力鉴定«规程»规定有具体标准（二）免疫原性鉴定攻毒保护试验（三）稳定性试验毒力是否稳定、是否反强四、毒种鉴定强毒毒种和弱毒毒种要根据各自的特性制订相应的标准。五、菌毒种的保存避免变异真空冷冻干燥（冻干），冻干的菌种4℃，毒种-20℃以下.第三章细菌培养第一节细菌繁殖的营养要求一、水二、碳源三、氮源四、无机盐五、生长因子：某些微生物不能利用普通碳源、氮源自身合成，而需要从外界得到补充，又是它生长繁殖所必需的有机物质。第二节培养基的主要成分与功用一、肉浸汁二、蛋白胨三、明胶四、琼脂五、酵母浸汁第三节培养基的种类与用途天然培养基合成培养基固体培养基液体培养基半固体培养基选择培养基：根据某一种类微生物的特殊营养要求或对某些物理、化学因素的抗性设计的一类培养基。鉴别培养基：含有特定指示剂的培养基。第四节培养基的制备程序第五节常用培养基第六节细菌的繁殖一、细菌群体的繁殖规律（一）迟缓期原因、特点（二）对数期原因、特点（三）稳定期原因、特点（四）衰亡期原因、特点二、影响细菌繁殖的因素（一）营养（二）温度接近最适生长温度时繁殖最快（三）氢离子浓度（PH）PH6—9PH7.0—7.6（四）二氧化碳自养菌（五）通气O2（六）渗透压第七节大量生产细菌培养方法一、固体表面培养法二、液体静置培养法三、液体深层通气培养法四、透析培养法五、连续培养法第四章病毒培养病毒增殖的特点：①活细胞内寄生缺乏完备的酶系统和合成蛋白质的场所；②病毒增殖方式为复制；③病毒增殖过程分为吸附、侵入、脱壳、生物合成、装配及释放。第一节动物培养一.动物的选择：对病毒易感，健康，最好为SPF动物二.动物接种方法：1.皮下2．皮内3．静脉4．腹腔5．脑内6．鼻腔滴入等三.接种后动物的饲养管理和收获病毒三.接种后动物的饲养管理和收获病毒在有良好隔离装置场地饲养不同组分开饲养接种动物出现典型症状者才能收获病毒第二节鸡胚培养一、鸡卵的选择与孵育：应来自健康鸡群，最好是SPF鸡群无母源抗体用浅色鸡蛋二、鸡胚接种：1.绒毛尿囊膜接种2.尿囊腔接种3.卵黄囊接种4.羊膜腔接种5.静脉、脑内接种三、收获鸡胚放4℃下过夜，消毒蛋壳包括组织块培养、器官培养和细胞培养。一般指细胞培养原代细胞：用新鲜组织制备。二倍体细胞：含双倍的染色体，能传50-100代。传代细胞：能够在体外无限传代的细胞。第三节组织培养培养液：基础培养液，有RPMI-1640、MEM等生长液：加5-10%小牛血清维持液：加1-2%血清影响细胞生长的因素1．温度37℃2．pH值7.0-7.46.8-7.63．气体O2、CO24．细胞接种量5．无菌条件单细胞的制备1.机械分散法2.酶消化法0.25%胰蛋白酶3.螯合剂分散法EDTA0.01%EDTA+0.025%胰蛋白酶混合液细胞培养关键：1、细胞的冻存与复苏