第九章 高等植物基因工程

第九章高等植物基因工程基因工程523416789基因工程的基本概念基因工程的基本原理基因工程所需的基本条件基因工程的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建大肠杆菌基因工程酵母基因工程哺乳动物基因工程高等植物基因工程A高等植物的遗传学特征9高等植物基因工程遗传操作的简易性整株植物的再生性染色体的多倍体性植物的基本特征植物的基本特征植物低等植物藻类地衣高等植物无根、茎、叶等分化器官合子不经胚直接发育为个体含根、茎、叶、花、果分化器官合子经胚再发育为个体苔藓门蕨类门裸子门被子门遗传操作的简易性大多数高等植物具有自我授精的遗传特征，通常能产生大量的后代；而且借助于如风、重力、昆虫传播等自然条件，授精范围广、速度快、效率高。因此，即便是频率极低的基因突变和重组事件，其遗传后果也易被观察。整株植物的再生性植物损伤后，会在伤口长出一块软组织，称为愈伤组织。如果将一小片鲜嫩的愈伤组织取下，放在含有合适营养和植物生长激素的组织培养基中，则这些细胞便会持续生长并分裂成悬浮液。将这些细胞涂在特定的固体培养基上，就会长成新的幼芽，并且这些愈伤组织重新分化成为叶、根、茎，最终成为整株开花植物。愈伤组织的细胞分化取决于植物生长素（Auxins）和分裂素（Cytokinins）的相对浓度。生长素与分裂素之比高，则根部发育；生长素与分裂素之比低，则茎部发育。整株植物的再生性植物细胞通常不能有效地吸收外源DNA，因为它们具有纤维素构成的细胞壁。可用纤维素酶处理植物细胞壁，形成原生质体，待吸收DNA分子后，经过再生，再通过愈伤组织形成培育出整株植物。这项技术有一定的局限性，即大多数单子叶农作物（如谷类作物）很难从原生质再生出完整细胞。染色体的多倍体性很多高等植物拥有比人类更大的基因组，并以多倍体的形式存在。大约三分之二的禾本科植物呈多倍体型，其染色体数目范围从24至144不等。这种多倍体植物在组织培养过程中呈现出较高的遗传不稳定性，导致体细胞变异。B高等植物基因工程的基本概念9高等植物基因工程高等植物基因工程高等植物细胞基因表达技术高等植物转基因技术转基因植株植物工程细胞农作物遗传性状改良蛋白多肽物质大规模生产小分子化合物大规模生产高等植物基因工程的发展历程1983年美国和比利时科学家首次将外源基因导入烟草和胡萝卜1994年世界上第一种耐储藏的番茄在美国批准上市1995年转基因的抗虫、抗除草剂的玉米和棉花在美国投入生产2000年美国转基因大豆的种植面积首次超过普通大豆迄今为止世界上共批准了12种作物、6大类性状的48个转基因品种进行商业化生产，其中包括水稻、玉米、马铃薯、小麦、黑麦、红薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亚麻、甜菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡萝卜、黄瓜、芦笋、苜蓿、草莓、木瓜、猕猴桃、越橘、茄子、梨、苹果、葡萄等。C高等植物的基因转移系统9高等植物基因工程Ti质粒介导的整合转化程序植物病毒介导的转染程序植物细胞的直接转化程序植物原生质体的再生程序Ti质粒介导的整合转化程序几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部常常会形成根瘤，这是由于植物根部被一种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌（A.tumefaciens）感染所致，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生Ti质粒的结构与功能型质粒Ti（Tumor-inducing）介导的。Ti质粒的结构与功能LBRBAuxiniaaMiaaH(tms)CytokininiptZ(tmr)Opine(tmt)Opine代谢区复制起始区Vir区TiplasmidTi质粒的图谱区代谢区复制起始区整个质粒160-240kbT-DNA其中T-DNA12-24kbtms的编码产物负责：合成吲哚乙酸tmr的编码产物负责：合成植物分裂素tmt的编码产物负责：合成氨基酸衍生物冠瘿碱Ti质粒的结构与功能Ti质粒致瘤的分子机制损伤的植物根部会分泌出乙酰丁香酸和羟基乙酰丁香酸，它们能诱导Ti质粒上的vir基因以及根瘤菌染色体上的一个操纵子表达。vir基因产物将Ti质粒上的T-DNA单链切下，而根瘤菌染色体上的操纵子表达产物则与单链T-DNA结合形成复合物，后者转化植物根部细胞。植物根部乙酰丁香酸羟基乙酰丁香酸植物细胞Ti质粒单链T-DNA根瘤菌细胞Ti质粒的结构与功能T-DNA的染色体整合机制表达特异性核酸内切酶单链T-DNA整合在植物的基因组上在LB和RB的第三和第四个碱基之间切开T-DNA的染色体整合机制Ti质粒的结构与功能Ti质粒的改造除去T-DNA上的生长素（tms）和分裂素（tmr）生物合成基因，因为大量的生长素和分裂素会抑止细胞再生长为整株植物；除去T-DNA上的有机碱生物合成基因（tmt）；因为有机碱的合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，影响植物细胞的生长；安装大肠杆菌复制子，使其能在大肠杆菌中复制，以利于克隆操作；安装植物细胞的筛选标记，如neor基因，使用植物基因的启动子和polyA化信号序列；安装多聚人工接头以利于外源基因的克隆。除去Ti质粒上的其它非必需序列，最大限度地缩短载体的长度；共整合转化程序大肠杆菌质粒大肠杆菌筛选标记农杆菌筛选标记多克隆位点重组质粒转化大肠杆菌农杆菌细菌接合T-DNA区同源整合农杆菌感染植物根部细胞T-DNA区整合在植物细胞基因组上二元整合转化程序LBRBT-DNA外源基因植物细胞筛选标记Kmr大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒大肠杆菌筛选标记农杆菌筛选标记农杆菌ori大肠杆菌ori将外源基因克隆在大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒的T-DNA区内；重组质粒直接转化农杆菌株，该菌株携带只含vir区不含T-DNA区的Ti辅助质粒；以上述重组农杆菌感染植物细胞。植物病毒介导的转染程序随着植物病毒分子生物学及遗传学研究的不断深入，用病毒基因组作为载体转化植物细胞日益受到人们的重视，因为病毒载体能将外源基因导入植物的所有组织和细胞中，而且不受单子叶或双子叶的限制。在大约300种特征清楚的植物病毒中，单链RNA病毒约占91%，双链RNA病毒、双链DNA病毒、单链DNA病毒各占3%。利用植物病毒载体转化植物细胞大致有以下两种战略：植物病毒介导的转染程序以双链DNA病毒花椰菜花斑病毒（CaMV）基因组作为载体，去除有关的致病性基因，换上外源基因，体外包装成有感染力的病毒颗粒，转染植物细胞原生质体，并由此再生成整株植物。转染植物细胞原生质体植物病毒介导的转染程序植物双生病毒（Geminiviruses）为一单链DNA病毒，成熟的双生病毒呈双颗粒状，每一个颗粒中含有一条不同的DNA单链。其中A链能单独在植物细胞中复制，并含有一部分病毒包衣蛋白基因；B链编码另一部分包衣蛋白基因及感染性基因。A、B两条链必须同处于一个植物细胞中，方能形成有感染力的病毒。双生病毒具有广泛的宿主细胞范围，因此是一种很有潜力的植物病毒载体。转染植物组织转染植物组织双生病毒家族成员蕃茄金花叶病毒（TGMV）克隆表达载体的构建程序TGMVA链TGMVdsDNA体外复制用目的基因和标记基因取代病毒包衣基因克隆穿梭质粒农杆菌筛选标记大肠杆菌筛选标记转化携带辅助质粒的农杆菌染色体上已整合了病毒B链基因的植物茎组织注射重组病毒感染其他植物组织并表达目的基因植物细胞的直接转化程序枪击法将待转化的DNA沉淀在细小金属珠的表面，用特制枪将金属珠直接打入植物细胞，枪的威力为430m/s，植物细胞通常是胚胎细胞、玉米籽、叶子等，但进去的DNA片段整合效率极低。电击法将高浓度的质粒DNA加入到植物细胞的原生质体悬浮液中，混合物在200-600V/cm的电场中处理若干秒钟，然后将原生质体在组织培养基中生长1-2周，再生出整株植物。融合法将外源DNA与特殊的疏水性高分子化合物混合，在水中这些疏水性化合物分子形成球状的脂质体，后者与植物细胞原生质体融合，筛选融合子，再生植物细胞壁。所有涉及到植物原生质体的基因转化方法均存在一个难题，即：原生质体很难再生出整株植物。花粉管导入法将外源DNA沿着花粉管经过珠心进入尚未形成正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞中，从而实现基因的转移。这一方法是我国科学家周光宇首先提出设计的，目前已应用于水稻、小麦、棉花、大豆、花生、蔬菜等作物的转基因研究，花粉管导入法的特点是直接、简便。它的受体材料为植株整体，省略了细胞组织培养的诱导和传代过程，排除了植株再生的障碍，特别适合于难以建立有效再生系统的植物。由于转化的是完整植株的卵细胞、受精卵或早期胚胎细胞，导入的DNA分子整合效率较高。植物原生质体的再生程序原生质体的再生效率在植物转基因技术中至关重要。标准的高等植物原生质体制备和再生程序是：将植物嫩叶、幼芽或愈伤组织切成碎片，浸入含有纤维素酶的缓冲液中保温；悬浮物离心除细胞碎片；将原生体悬浮液滴在无菌滤纸片上，并置于含有普通植物细胞（即所谓的滋养细胞）的固体再生培养基的表面，使原生质体与滋养细胞不直接接触，但可吸收由滋养细胞分泌扩散出来的植物生长因子及其它化合物；培养2-3周后，将滤纸上的植物细胞蔟转移至含有高浓度分裂素和低浓度生长素的固体培养基上继续培育2-4周，滤纸片上便长出嫩芽；将嫩芽置入含有低浓度生长素而无分裂素的固体培养基上，使其根部发育；大约3周后再将之移植在土壤中，长成整株植物。植物原生质体的再生程序D高等植物的基因表达系统9高等植物基因工程植物转基因技术已成为研究和改良植物遗传资源的强有力工具，其中启动子是决定基因表达部位、时间、强度的主要调控元件。花椰菜花斑病毒CaMV的35S启动子能在许多植物物种中的几乎所有发育阶段及所有组织中高效表达，它已经被广泛用于构建转基因植株。在高等植物基因工程中，外源基因的时空特异性表达具有重要意义，因为很多外源基因的表达产物对植物早期的生长和发育有影响，甚至会致死植株。D高等植物的基因表达系统9高等植物基因工程外源基因的四环素诱导系统外源基因的乙醇诱导系统外源基因的地塞米松诱导系统外源基因的类固醇诱导系统外源基因的四环素诱导系统Tc-on型四环素诱导系统CaMV35SPPlantnostTetRE.colitetR四环素阻遏蛋白基因表达盒CaMV35SPPlantnostb-葡糖醛酸糖苷酶报告基因GUS四环素诱导型报告基因表达盒tet外源基因的四环素诱导系统Tc-on型四环素诱导系统TetRCaMV35SPPlantnostb-葡糖醛酸糖苷酶报告基因GUStetCaMV35SPPlantnostb-葡糖醛酸糖苷酶报告基因GUStet显色反应四环素外源基因的四环素诱导系统Tc-off型四环素阻遏系统CaMV35SPPlantnosttTA融合蛋白tetRtTA激活因子表达盒CaMV35SPPlantnost荧光蛋白编码基因GFP四环素阻遏型报告基因表达盒tetVP16外源基因的四环素诱导系统Tc-off型四环素阻遏系统CaMV35SPPlantnost荧光蛋白编码基因GFPtetCaMV35SPPlantnost荧光蛋白编码基因GFPtet四环素外源基因的乙醇诱导系统CaMV35SPPlantnostAlcR巢曲霉菌alcR转录激活因子表达盒CaMV35SPPlantnost氯霉素乙酰转移酶基因CAT乙醇诱导型报告基因表达盒alcA启动子控制区alcA巢曲霉菌乙醇降解酶编码基因外源基因的乙醇诱导系统CaMV35SPPlantnostAlcR巢曲霉菌alcR转录激活因子表达盒CaMV35SPPlantnost氯霉素乙酰转移酶基因CAT乙醇诱导型报告基因表达盒乙醇氯霉素抗性外源基因的地塞米松诱导系统CaMV35SPPlantnosttTA融合蛋白YeastGal4tTA激活因子表达盒PlantPPlantnost荧光蛋白编码基因GFP地塞米松诱导型报告基因表达盒Gal4结合区VP16地塞米松诱导系统RatGR酵母转录因子Gal4大鼠激素受体蛋白单纯疱疹病毒转录激活因子外源基因的地塞米松诱导系统CaMV35SPPlantnosttTA融合蛋白YeastGal4VP16地塞米松诱导系统RatGRPlantPPlantnost荧光蛋白编码基因GFPGal4结合区地塞米松外源基因的地塞米松诱导系统35SPpAcostV