高效液相色谱分析法 HPLC

第八章高效液相色谱分析法HighPerformanceLiquidChromatograph§8.1概述Chromatography~利用当流动相带着混合组分在固定相间流动时，由于各组分在两相中有不同的吸附能力、溶解度或渗透性等特性，因而当两相作相对运动时，组分会在两相间进行反复多次分配，使原来微小的分配差异变大，移动速度不同，从而使混合组分得到分离Temporalcourse淋洗液慢中等快1.发展历史1906RussianbotanistTsweet经典液相色谱法toseparatethevariousplantspigments1941,MartinandSyngeLiquid-liquidpartitionchromatography1952，MartinandJamesGaschromatography60年代采用高压输液泵的高效液相色谱法70年代采用电导检测器的离子交换色谱法80年代末毛细管电泳分离法石油醚(mobilephase)CaCO3颗粒(stationaryphase)Baseduponthephysicalstatusofthemobilephase流动相•Gaschromatography（气相色谱法）:Gas-solidchromatography(气-固色谱法)~固定相为固体吸附剂Gas-liquidchromatography(气-液色谱法)~固定相为涂在固体担体或毛细管内壁上的液体–Liquidchromatography（液相色谱法）:Liquid-solidchromatography(液-固色谱法)~固定相为固体吸附剂Liquid-liquidchromatography(液-液色谱法)~固定相为涂在固体担体上的液体–Superficial-fluidchromatography(超临界流体色谱法)Mobilephaseisasubstanceattemperatureandpressureaboveitscriticalpoint2.ClassificationofChromatographicmethods液相色谱法分类类型主要分离机理主要分析对象或应用领域吸附色谱吸附能，氢键异构体分离、族分离，制备分配色谱疏水分配作用各种有机化合物的分离、分析与制备凝胶色谱溶质分子大小高分子分离，分子量及其分布的测定离子交换色谱库仑力无机离子、有机离子分析离子排斥色谱Donnan膜平衡有机酸、氨基酸、醇、醛分析离子对色谱疏水分配作用离子性物质分析疏水作用色谱疏水分配作用蛋白质分离与纯化手性色谱立体效应手性异构体分离，药物纯化亲和色谱生化特异亲和力蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析3.高效液相色谱法的特点特点：分离效能高、选择性高、检测灵敏度高、分析速度快应用：高沸点、大分子量、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析高效液相色谱法与经典液相色谱法比较高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于：高速、高效、高灵敏度、高自动化高效液相色谱法与气相色谱法比较分析对象GC：只限于分析气体和沸点较低的化合物（占有机物总数的20％）HPLC：可分析高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质（占有机物总数近80％）流动相GC：流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用HPLC：流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此流动相对分离起很大作用操作温度GC：一般都在较高温度下进行HPLC：通常在室温条件下工作4.高效液相色谱法的应用•适于高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质的分析•在工业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。•如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析右图是各种HPLC方法的应用范围及对象分子量HPLC的局限性使用多种溶剂做流动相，成本高，污染大当使用梯度洗脱时，操作比GC的程序升温复杂缺少通用型的检测器不能替代毛细管GC去完成柱效高达10万块塔板以上的复杂体系的分离（如多沸程的石油产品）不能替代中、低压色谱，在200kPa~1MPa下去完成在高压下易分解、变形的具有生物活性的生化样品的分离§8.2高效液相色谱仪HPLC仪器包括：高压输液装置(Deliverysystem)进样系统(Injectionsystem)分离系统(Separationsystem)检测系统(Detectionsystem)(梯度淋洗、自动进样和数据处理装置)液相色谱仪WatersHPLC1.流动相贮存与脱气贮液罐一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成，容量为1到2L，用来贮存足够数量、符合要求的流动相流动相输出端配0.45m膜过滤器，防止颗粒物进入泵内流动相脱气作用：防止在洗脱过程中，当流动相由色谱柱流入检测器时因压力降低而产生气泡消除溶解在流动相中的氧的影响氧会造成荧光猝灭还会使样品组分氧化或使固定相分解而导致柱分离性能改变脱气方法：真空泵抽滤脱气：单一溶剂低溶性惰性气体导入替换:氦气超声脱气在线真空脱气（On-linedegasser）实现流动相在进入高压泵前的连续在线脱气和过滤2.高压泵和梯度洗脱装置(1)高压输液泵压力：150～350×105Pa作用：将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统对输液泵的基本要求能在高压下连续工作流量准确可调0.1-10mL/min输出流量稳定耐腐蚀（耐酸不锈钢、PEEK聚醚醚酮）泵的死体积小（小于0.5mL）输液泵种类：–恒压泵：可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但输出流量随色谱系统阻力变化而变化，现已较少使用–恒流型：溶剂流量恒定，与柱填充情况无关机械注射式恒流泵机械往复式恒流泵：每分钟往复25~100次，脉动小(2)梯度洗脱装置梯度洗脱(GradientElutionorSolventProgramming):在样品分离过程中，按一定程序连续改变流动相中的两种或两种以上溶剂的比例，以改变流动相的极性、离子强度和pH等，从而改变被测组分的相对保留值，提高分离效率，加快分离速度适用于组分分配比k相差很大的体系梯度洗脱类型:–线性梯度：在某一段时间内连续而均匀增加流动相强度–阶梯梯度：直接从某一低强度流动相改变为另一较高强度流动相根据溶液混合的方式可以将梯度洗脱分为–高压梯度（内梯度）:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱可获得任意形式的梯度，易于实现自动化溶剂的可压缩性和溶剂混合时热力学体积变化可能影响流动相的组成–低压梯度（外梯度）:一台高压泵，通过比例调节阀，将两种或多种不同极性的溶剂按一定比例抽入混合器中混合，然后由高压泵输送至色谱柱中消除由于溶剂混合引起的热力学体积变化的影响可减小溶剂可压缩性的影响3.进样装置进样要求：将样品定量的、瞬间注入到色谱柱头填料中心，形成集中的一个点（柱塞式进样）进样装置:1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差2）高压进样阀：目前最常用的为六通阀由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好3)自动进样器装入样品出口进样采样环泵入溶剂进色谱柱4.色谱柱对色谱柱的要求：内壁光滑的直型不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小柱长多为10~30cm，内径为4~5mm尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色谱柱内径更大发展趋势是减小填料粒度以提高柱效柱外效应引起的峰形扩展不可忽视uDdCDdCDdCuDCdHmpsmmpmsfsmdp][2222涡流扩散项He纵向扩散项Hd固定相传质阻力项Hs流动相迁移传质阻力项Hm流动相滞流传质阻力项Hsm柱的填充（Packing）：•干法：粒度20μm•湿法（匀浆法）：粒度20μm平衡密度法：使溶剂密度和填充颗粒密度相近，此时颗粒沉降速度趋于0–常用的匀浆试剂有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等填充方法：–用流动相充满色谱柱及其延长管中，然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内–要求填充速度快(防凝聚、沉降或结块)、且无空气进入(影响填充均匀性)5.液相色谱检测器•溶质性检测器(SolutePropertyDetectors)：只检测色谱柱后流出液中组分的物理、化学性质的变化•紫外检测器(UVAbsorbanceDetector)•荧光检测器(FluorescenceDetector)•总体检测器(BulkPropertyDetector)：检测从色谱柱流出的流动相和组分总体物理性质的变化•示差折光检测器(DifferentialRefractometricDetector)•电导检测器(ConductivityDetector)5.液相色谱检测器a.紫外检测器•检测原理：和UV-Vis方法一样•应用最广：HPLC分析中，约80%的物质可以在254或280nm处产生紫外吸收•采用微量吸收池，通常其光程为2-10mm,体积约为1-10L•特点：•灵敏度高•线形范围大•波长可选，易于操作•对流动相的流速和温度变化不敏感•可用于梯度洗脱石英窗接色谱柱UV光电倍增管废液光电二极管阵列检测器紫外检测器的重要进展光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，可分别同时检测特定波长(180-600nm)10ms内完成一次检测计算机快速处理三维立体谱图快速扫描—光电二极管阵列（PDA）检测所获得的三维色谱-光谱图波长可的松氟美松皮质酮b.示差折光检测器（differentialrefractiveindexdetector）原理：通过连续测定参比池和测量池中溶液的折射率之差，来测定样品的浓度•特点：•通用型检测器（除紫外检测器之外应用最多的检测器）•对温度敏感、不能用于梯度洗脱•灵敏度低（10-7g/mL）•偏转式、反射式和干涉型三种•干涉式折光指数检测器•造价高•用的较少•偏转式：•利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品+溶剂相，利用二者对光的折射率不同，其中一束（通常是通过样品+溶剂相）光因为发生偏转造成两束光的强度差发生变化，将此差示信号放大并记录，该信号代表与样品的浓度呈正比•流通池体积大（10L）•可用于各种溶剂折射率的测定反射式折光指数检测器•通过测定经流动相折射后反射光的强度变化，来测定组分的含量•流通池体积小（3L）•用于不同溶剂折射率的测定时需更换流通池•1.31-1.44和1.40-1.60c.荧光检测器（Fluorescencedetector）原理：许多有机化合物，特别是芳香族化合物、生化物质，被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光特点：高灵敏度、高选择性所需样品量很小应用：多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等对部分不产生荧光的物质，可先衍生化在测定d）电导检测器•原理：基于待测物在一些介质中电离后所产生的电导（电阻的倒数）变化来测量电离物质的含量•电导检测器的构成：由电导池、测量电导率所需的电子线路、变换灵敏度的装置和数字显示仪等几部分组成，电导池是其核心。•响应受温度影响较大，因此需要将电导池置于恒温箱中•不能用于梯度洗脱•当pH7时，该检测器不够灵敏•电导检测器主要用于离子色谱的检测溶液至检测池电极检测池e)蒸发激光散射检测器（Evaporativelaserscatteringdetector,ELSD）原理：基于溶质的光散射性质属通用型和质量型检测器消除了溶剂干扰和温度变化引起的基线飘移可用于梯度洗脱适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测接参比电极和对电极接色谱柱Teflon塑料块1cm工作电极(Pt,Au,碳糊)f）安培检测器由恒电位仪和一薄层反应池（体积为1~5L）组成原理：利用待测物流入反应池时在工作电极表面发生氧化或还原反应，两电极间就有电流通过，此电流大小与待测物浓度成