第三章 植物细胞和动物细胞培养反应器

第三章植物细胞和动物细胞培养反应器第一节植物细胞培养反应器植物细胞培养：是指在离体条件下将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中，将组织振荡分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖来获得大量细胞群体的方法。表1植物细胞培养和从完整的植物生产紫草宁的比较生产方式收获时间紫草宁浓度（%干重）完整植物2-3年1-2植物细胞培养21天14一、植物细胞培养过程的特点1、培养液中植物细胞的特性植物细胞比微生物细胞大植物细胞通常以细胞数在2-200之间、直径为2mm左右的非均相集合细胞团方式存在植物细胞抗剪能力弱2、细胞培养液的流变学性质植物细胞培养液的粘度随着细胞浓度的增加而显著上升3、植物细胞培养过程中的氧传递所有植物细胞都是好气性的，需要连续不断地供氧。二氧化碳的浓度对细胞的生长也相当重要。4、泡沫和表面粘附性气泡较大，覆盖有蛋白质和粘多糖，粘性大，易粘附于培养液表面以上的器壁上5、悬浮细胞的生长与增殖细胞数量随时间的变化曲线呈现“S”形。细胞生长经历：延迟期、对数生长期、直线生长期、减慢期和静止期。6、悬浮培养的优点增加培养细胞与培养液的接触面及时带走培养物产生的有害代谢产物保证了氧的充分供应二、植物细胞培养反应器培养方式：悬浮培养和固定化细胞培养1、悬浮培养生物反应器(1)机械搅拌式反应器优点:是能够获得较高的溶氧系数。缺点:剪切力大。2、固定化细胞生物反应器（1）填充床生物反应器特点：细胞固定于支撑物表面或内部，支撑物颗粒堆叠成床，培养基在床层间流动。优点：单位体积固定细胞量大。缺点:混合效果差，使溶氧、pH、温度控制、气体的排出较难。（2）流化床生物反应器特点：利用流体的能量来悬浮颗粒。优点：小颗粒传质特性良好。缺点：剪切力和颗粒碰撞会损坏固定化细胞。（3）膜生物反应器中空纤维反应器螺线式卷绕反应器中空纤维反应器：细胞保留在管外，基质走管内螺旋式卷绕反应器：将固定有细胞的膜卷成圆柱状优点：可重复使用，可以采用较厚的细胞层缺点:投资大第二节动物细胞培养反应器动物细胞培养的产物举例疫苗小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、脑炎疫苗、疱疹疫苗、风疹疫苗单克隆抗体IgG、IgM、IgA等免疫调节剂细胞生长因子、干扰素、白细胞活化因子、胸腺素酶胰蛋白酶、尿激酶、胶原酶、胃蛋白酶激素生长激素、促红细胞生成素一、动物细胞培养过程的特点动物细胞培养定义将动物组织或细胞从机体取出，分散成单个细胞，给予必要的条件，模拟体内生长环境，使其在体外继续生长和繁殖。1、动物细胞与微生物细胞的性质比较性质动物细胞微生物细胞大小代谢调节方式营养要求生长速率机械强度环境适应性10-100um内部和激素苛刻倍增时间一般为12-60h很差，缺乏保护性细胞壁差10um内部宽松，可利用多种底物倍增时间一般为0.5-2h较好好表动物细胞与微生物细胞的性质比较2、动物细胞与微生物细胞的培养方法比较性质动物细胞微生物细胞PH控制搅拌速度溶氧控制培养基灭菌方法培养时间对水纯度的要求CO2—HCO3缓冲液较慢改变进入气体的氧浓度过滤几天~3、4周很高添加酸、碱速度快、范围广改变搅拌速度、通气量等高温蒸煮几小时~几天较低表动物细胞与微生物细胞的培养方法比较二、动物细胞培养方法贴壁培养悬浮培养固定化培养1.贴壁培养是指必须贴附在固体介质表成上生长的细胞培养。2.悬浮培养是指细胞在培养器中自由悬浮生长的过程。3.固定化培养是既适用于贴壁依赖性细胞，又适用于非贴壁依赖性细胞的包埋培养方式。三、细胞培养的操作方式培养方式分为：分批式流加式半连续式连续式灌注式1、分批式培养分批式培养：指先将细胞和培养液一次性装入反应器内进行培养，细胞不断生长，产物不断形成，经一段时间后，终止培养。特点：分批式培养过程的环境随时间变化很大细胞的生长阶段可分为延滞期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期。(3)在分批培养过程中,与细胞的生长、代谢相关的主要参数有细胞密度及其比生长速率限制性营养物质及其比消耗速率产物浓度及其比生长速率抑制物浓度2、流加式培养特点：可避免某种营养成分的初始浓度过高；能防止营养成分在培养过程中被耗尽；整个过程反应体积是变化的。培养过程各参数的变化可写为：d（VX）/dt=uVXV---培养液的体积；X--为t时间时的细胞密度；u--为细胞的比生长流加方式：(1)无反馈控制流加(2)反馈控制流加3、半连续式培养指在分批式培养的基础上，将分批培养的培养液部分取出，并补充加入等量的新鲜培养基，使反应器内培养液的总体积保持不变。4、连续式培养连续式培养：使反应条件处于一种恒定状态。特点：细胞所处环境条件长时间地稳定5、灌注培养灌注培养：是把细胞接种后进行培养，新鲜的培养液从反应器一头不断加入，从另一头不断取出等量的培养液，细胞仍留在反应器内，使细胞处于一种营养不断的状态。特点：高密度培养动物细胞图（生化生产工艺学P221）三、动物细胞大规模培养反应器1、通气搅拌式细胞培养反应器工作原理:反应器运转时，圆筒以30-60r/min的速度转动，由于离心力的作用，搅拌器中心管内产生负压，使搅拌器外培养基流入中心管，沿管螺旋上升，再从导流筒口排出，从搅拌器外沿下降，形成循环流动。在气腔内气体由分布管鼓泡，气体溶于液体中，依靠气腔丝网外液体的循环流动及扩散作用，使溶于液体中的气体成分均匀地分布到反应器内。反应器的优缺点优点：避免向培养基直接通气时气泡损伤细胞，没有移动部件，密封好，氧转换率较高，便于放大。缺点：氧传递系数小，气路系统不能就地灭菌。反应器适用范围悬浮培养：非贴壁依赖性细胞和贴壁于微载体的贴壁细胞2、气升式动物细胞培养反应器与微生物发酵及植物细胞培养的反应器结构相同。优点:器内湍流温和均匀剪应力小，完全密封，便于无菌操作，氧的转换率高，便于放大生产。3、中空纤维细胞培养反应器1）结构2）用途:培养悬浮生长的细胞和贴壁依赖性细胞3)优点培养器体积小，细胞密度高；浓缩产品；产物纯度高；自动化程度高，细胞生长周期长。4)缺点:价格高(1)优点培养器体积小，细胞密度高；浓缩产品；产物纯度高；自动化程度高，细胞生长周期长。(2)缺点:价格高4、微载体悬浮培养系统微载体悬浮培养定义：用微珠作载体，使单层动物细胞生长于微珠表面，可在培养液中进行悬浮培养。微载体：贴壁培养动物细胞的载体微珠。反应器:可用与悬浮培养相同设备优点：比表面积大；生长条件易控制且易放大，兼贴壁与悬浮培养的优势，取样方便；易于分离。微载体悬浮培养反应器应解决的问题：搅拌适度，剪切应力小；能满足细胞所需的溶氧浓度；能严格控制PH值。微载体悬浮培养优点：比表面积大；生长条件易控制且易放大，兼贴壁与悬浮培养的优势，取样方便；易于分离。5、微囊培养系统微囊技术：将生物活性物质、完整的活细胞或组织包在薄的半透膜内。微囊制作：将活性细胞悬浮于海藻酸钠溶液中将活性细胞悬浮液按一定的液滴大小滴入氯化钙溶液中形成含活细胞的凝胶小珠用半透膜材料包被，制成半透性外膜6、大载体系统培养大载体：由海藻酸钠构成大载体制作：配制50mmol/L氯化钙溶液将活性细胞悬浮于低粘度的海藻酸钠凝胶中混匀按适宜速度喷珠于氯化钙溶液中抽出氯化钙溶液，用生理盐水洗2次第三节微藻培养反应器一、微藻生物技术的优越性1、光能利用率高；2、易收获和加工；3、商品价值高；4、繁殖快。二、微藻在规模培养过程中的特点1、光照充足，PH、温度合适，无机碳源充足；2、强化二氧化碳的吸收和大量氧气的排出；3、混合效果好；4、避免污染；5、设备防腐蚀性好。三、微藻大规模培养反应器(一)敞开式(二)封闭式封闭式光生物反应器主要类型管式、板式以及一些其他特殊类型1、管式光生物反应器1）水平放置地面的蛇形管式光生物反应器用有机玻璃为材料制作，管道平行排列水平放置于地面。2）浸没在水中冷却的管式生物反应器反应器的管道材料是聚乙烯塑料,集光管放在水池中3)气升式内环流光生物反应器反应器由气升管道、下降管、除气室、在线检测与控制系统，光照、热交换和供气系统组成。4）管道式循环磁处理光生物反应器（教材）用有机玻璃或透明塑料制作2、管式光生物反应器开发设计的主要发展趋势1）管径减小并稳定在一定范围内2）集光管的排列向空间发展3）降低管路阻力提高藻液流速4）普遍采用气升循环混合系统3、板式光生物反应器1）水平放置的板式光生物反应器这种反应器由具有三层壁的单元板组合而成,单元板的内部结构与空心瓦的内部结构类似。2）浅层溢流板式光生物反应器反应器由多个平行的板组成4、板式光生物反应器的发展趋势1）板式光生物反应器板面趋向于空间立体放置。2）板式光生物反应器光路长度向宽的方向发展。思考题1、比较植物、动物、微生物细胞的结构和生理特点。2、描述植物细胞、动物细胞生物反应器的共性。各有何优缺点。3、你认为最适合于植物细胞、动物细胞培养的生物反应器、培养方法及操作方式，并说明其理由。