激光共聚焦显微镜原理和操作

激光扫描共焦显微镜技术•样品要求•原理•功能•在生物医学中的应用激光扫描共焦显微镜技术及应用ThetechniquesandapplicationofConfocalLaserScanningMicroscopy激光扫描共焦显微镜技术人眼分辨率：0.2mm光学显微镜分辨率：0.25mm电子显微镜分辨率：0.2nm共焦显微镜分辨率：0.18mm二、原理激光扫描共焦显微镜技术原理小结:Confocal利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔上，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即共焦点，被探测点所在的平面即共焦平面。计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光切图像。激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术激光扫描共焦显微镜技术•共焦显微镜与传统显微镜的区别1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像激光扫描共焦显微镜技术•共焦显微镜与传统显微镜的区别2.具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片conventionalconfocal激光扫描共焦显微镜技术•共焦显微镜与传统显微镜的区别3.增加侧向分辨率d2alconventionconfocaldd激光扫描共焦显微镜技术•共焦显微镜与传统显微镜的区别4.由于点对点扫描去除了杂散光的影响激光扫描共焦显微镜技术三.激光扫描共焦显微镜的设计特点:1.点照明2.具有照明pinhole和探测pinhole3.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦),共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面4.具有扫描系统——逐点扫描成像5.具有多个（四个）荧光通道，可同时探测多个被标记物激光扫描共焦显微镜技术•技术指标（LeicaTCSSP2):1.xy分辨率比传统显微镜小1.4x传统显微镜:Rxy=0.61/NA（0.25mm)Confocal:Rxy=0.4/NA（0.18mm)2.样品的最大厚度:取决于:物镜的NA、物镜的工作距离激光的穿透力、样品的透明度Z轴的最大移动范围(166mm、Z-wide)3.样品的最小光切厚度:(载物台最小移动距离为40nm）取决于:物镜的NA、针孔大小Z轴的最小移动步距:40nmZ轴的分辨率:0.35mm激光扫描共焦显微镜技术4.激光器Ar激光器:458nm,476nm,488nm,514nmGreNe:543nm;HeNe:633nmAr激光器(UV):361nm•激光器的特点:1)方向性好:激光基本延直线传播2)单色性好:=10-8nm3)高亮度:激光方向性好,其在空间上的能量分布是高度集中的。4)偏振性:激光为平面偏振光,光纤耦合激光扫描共焦显微镜技术5.四个荧光通道,一个透射光通道即除了可同时采集多标记荧光图像外还可以同时采集透射光图像,但透射光图像为非共焦图像。激光扫描共焦显微镜技术6.扫描速度:slow220lines/s5125122-3秒slow2440lines/s（2：双向扫描）medium450lines/s5125121.7秒medium2900lines/sfast1000lines/s5125120.7秒1281280.2秒fast22000lines/s7.扫描密度:64641281285125121024102420482048激光扫描共焦显微镜技术的应用TheapplicationofConfocalLaserScanningMicroscopy激光扫描共焦显微镜应用功能.1.多荧光标记样品的高清晰度、高分辨率图像采集2.无损伤、连续光学切片，显微“CT”3.真正的三维重组4.假三维图的显示5.可沿Z轴（xy平面）和Y轴（xz平面）方向进行光切6.定量分析7.时间序列扫描:xyt、xyzt和xt扫描8.图像处理9.旋转扫描10.感兴趣区域扫描11.光谱扫描激光扫描共焦显微镜应用应用•定位、定量•三维重组•动态测量活细胞或组织内游离Ca2+分布和浓度的变化测量(Mg2+、Zn+、Na+、K+)自由基的检测药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量蛋白质的转位激光扫描共焦显微镜应用•活细胞内H+浓度（pH值）的测量•线粒体膜电位的测量•荧光漂白恢复（FRAP）的测量•笼锁解笼锁的测量•荧光能量共振转移（FRET）的测量•其他应用激光扫描共焦显微镜应用一、定位、定量•免疫荧光标记（单标、双标或三标）的定位、定量：如：细胞膜受体或抗原的分布，微丝、微管的分布、两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与细胞器的共定位、核转录因子转位和干细胞的增值、分化•细胞凋亡:AnnexinV-fitc+PI末端原位杂交-fitc+PI•荧光原位杂交：染色体基因定位激光扫描共焦显微镜应用•定位、定量研究中常用荧光探针1.Amine-ReactiveProbes与抗体耦联、与配体耦联、与肽耦联、与人工合成的寡聚核苷酸耦联的探针，可用于免疫组化、荧光原位杂交、受体标记等GreenRedFura-redFITC494/518TRITC544/572Cy5650/690(异硫氰基荧光素)(四甲基异硫氰基罗丹明)AlexaFluor488488/530PE565/578(藻红蛋白)TexasRed595/615(德州红)Cy3558/568BODIPYFL503/512BODIPYTMR543/569BODIPYTR592/618激光扫描共焦显微镜应用1)细胞表面抗原、胞内某种蛋白免役荧光标记：与抗体耦联,直标:一抗+荧光探针间标:二抗+荧光探针如:微管蛋白tublin(抗tublin抗体+荧光探针)肌动蛋白actin(Palloidine+荧光探针)2)细胞膜表面受体配体+荧光探针如:nAchR、mAchR、多巴胺受体(D1,D2)标记Gm1:霍乱毒素受体霍乱毒素+FITC激光扫描共焦显微镜应用2.标记细胞器荧光探针1)线粒体MitochondriaRodamin123505/534，可染活细胞，阳离子,可检测线粒体膜电位,且在多数细胞中停留时间短JC1线粒体膜电位低时为单体490/527发绿光线粒体膜电位高时为多聚体490/590发红光可标记活细胞线粒体，且为检测线粒体膜电位最佳探针MitotrackerGreenFM490/516,染活细胞或固定细胞,稳定不漏出MitotrackerOrangeCMTMRos551/576,(氧化型)MitotrackerOrange还原型,只能染活细胞激光扫描共焦显微镜应用2)溶酶体Lysosome中性红541/640:微偏碱性,可标记溶酶体等酸性器官为非特异性AO:LysoTrackerGreenDND-26504/511,染活细胞LysoTrackerBlueLysoTrackerRed3)内质网EndoplasmicReticulumDiOC6484/500:非特异性,较高浓度标记内质网,较低浓度标记线粒体4)高尔基体GolgiapparatusNBDC6-ceramie466/536,可染活或死细胞激光扫描共焦显微镜应用细胞器的单克隆抗体5)细胞核PIpropidiumiodide536/617DNA/\RNA死细胞碘化丙啶EBethidiumbromide518/617DNA/RNA死细胞Hochest33342352/461DNAA-T活细胞Hochest33258352/461DNAA-T活细胞DAPI358/461DNAA-T半通透细胞ChromomycinA3450/470DNAG-CAO500/526DNA活细胞560/650RNATOTO-1514/533DNA死细胞SYTO11~1620~24488/520活细胞SYTO11~1620~24521/556活细胞SYTO17621/634活细胞3.GFP绿色荧光蛋白GFP的的发现：60年代，Shimomura等首先从水母中分离出一种水母发光蛋白(aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水母整体几提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白GFP,后经研究表明，在水母体内Ca2+和肠腔素与水母发光蛋白结合后，水母发光蛋白产生蓝色荧光，GFP在蓝光的激发下，产生绿色荧光。将外源基因与GFPDNA相连,GFP可作为外源基因的报告基因实时监测外源基因的表达.激光扫描共焦显微镜应用激光扫描共焦显微镜应用GFP主要应用:•对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中或外界刺激因子的作用下的时空表达,如某种转录因子的核转位、蛋白激酶C的膜转位等。•GFP基因与分泌蛋白基因连接后转染细胞,可动态观察该分泌蛋白分泌到细胞外的过程•GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连,就能显示活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞器的结构及病理过程•可用于观察分子的运动（FRAP）•蛋白之间的相互作用（FRET）激光扫描共焦显微镜应用三.动态测量•Physiology:细胞内离子动态变化测量1).游离Ca2+测量检测游离Ca2+变化荧光探针的原理：这类探针多为Ca2+螯合剂，不与Ca2+结合时不发荧光，通常也不能进入细胞膜，只有与乙酰甲酯AM相连方可进入细胞内，被细胞内酯酶水解后并与胞内游离钙结合后发出荧光。Kd值为Ca2+解离常数，表明检测Ca2+浓度的范围:0.1xKd-10xkd,Kd和很多因素有关，如pH、Mg2+、与蛋白的结合、温度等。细胞内生理Ca2+浓度值(10-100nM)，细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右）荧光探针激发波长发射波长KdFLuo3-AM,K+,dextran506nm525nm390nMFluo4506nm525nmCalciumGreen-1507nm530nm190nMCalciumGreen-2507nm535nm550nMFurared420/480nm637nm140nMOregonGreen488494nm520nm20,000nMCalciumCrimson583nm602nm328nMIndo-1356nm405/458nm230nMFura-2340/380476nm145nM激光扫描共焦显微镜应用•程序化测量：用timelapse中的编程按钮可进行不同时间序列的扫描测量。F/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)Ca2+浓度绝对测量1）单波长公式法Fluo3:530nmKd=450nM[Ca2+]I=Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)Fmin:细胞内无钙时的荧光强度(MnCl2)Fmax：细胞内钙饱和时的荧光强度(A23187)•测量时切记细胞内静息Ca2+浓度的相对荧光强度值不能太低（F值不低于40）激光扫描共焦显微镜应用细胞内生理Ca2+浓度值（10-8-10-7M）细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右）2）标准曲线法根据仪器条件和负载条件，以不同Ca2+浓度的Buffer(EGTA-Ca2+)做标准曲线，横轴为Ca2+浓度，纵轴为荧光强度3）比例荧光的测量.双波长(比例荧光：ratio)Indo1(360,420/480),fura2(340/380,440)[Ca2+]I=Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)Ff2/Fs2激光扫描共焦显微镜应用激光扫描共焦显微镜应用快速Ca2+变化的测量1.改变扫描速度2.采用双向扫描3.减少采样点数(牺牲空间分辨率）4.采用线扫描(xt)•细胞器的Ca2+测量1.线粒体内游离Ca2+测量Fluo-3+TMRM(线粒体荧光探针，红