实验一蛋白质含量测定

实验一蛋白质含量的测定姓名：mangogola一．实验原理生物化学实验中，经常需要测定蛋白质的含量，一般常用的蛋白质含量测定方法有紫外吸收法、福林酚试剂法以及一些改进的Lowry法可以应用。紫外吸收法测定蛋白质含量的原理是由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸中的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在280nm处，且蛋白质溶液的光密度值与其含量呈正比关系。该方法具有简单、灵敏、快速和不消耗样品的优点，但易受核酸分子中嘌呤、嘧啶等的干扰，准确度较差。根据蛋白质和核酸的吸收峰不同，可通过计算适当校正核酸的干扰作用。Lowry法的原理是：在碱性条件下，蛋白质与铜离子形成铜-蛋白质复合物，该复合物可还原磷钼酸-磷钨酸（Folin试剂）产生深蓝色的钼蓝和钨蓝混合物。该方法灵敏度较高，但较费时。对膜蛋白或相当稀的（如1ug/ml）蛋白溶液的含量测定，以及为减小去污剂、脂类、碳水化合物的干扰，可采用一些改进的Lowry法，如蛋白质-染料结合法。原理是：当染料考马斯亮蓝G250与蛋白质结合时，最大吸收峰从465nm移动到595nm，而且吸收值在一定蛋白浓度下线性相关，因此用标准浓度的蛋白测OD595作标准曲线，即可求得待测样品的蛋白浓度。此方法简单经济、快速、灵敏度也较高。需要注意的是，染料与蛋白质可在3min内完成结合，由于染料试剂中含有酒精成分，易挥发，所以结合生成的复合物在1h内可比较稳定地存在于溶液中，制作的标准曲线后部会出现弯曲现象。二．实验过程（Lowry法）1.溶液配制A液：2%Na2CO3，用0.1mol/LNaOH配制。（不能将NaOH和Na2CO3干粉混合配制，这样会因释放CO2而不准确）B液：0.5%CuSO4.5H2O,用1%酒石酸钾或酒石酸钠配制。C液：使用前将A、B液按50:1混合，当天使用。D液：Folin试剂标准蛋白溶液：200ug/mLBSA溶液2.标准曲线测定按照下表进行操作，用一系列标准浓度的BSA平行进行两组测定反应，记录A500。取两组测定的平均值，以蛋白浓度为横坐标，光密度值为纵坐标绘制标准曲线。3.将待测样品稀释至标准曲线浓度范围内，同时按上述方法测A500，根据标准曲线读出蛋白浓度。试管编号0112233445566标准蛋白00.050.050.10.10.20.20.30.30.40.40.50.5水0.50.450.450.40.40.30.30.20.20.10.100试剂C2.52.52.52.52.52.52.52.52.52.52.52.52.520-25℃放置10min试剂D0.250.250.250.250.250.250.250.250.250.250.250.250.25立即振荡摇匀，20-25℃水浴30minA50000.0110.010.0280.0270.0590.060.0870.0880.1140.1150.140.141平均值00.01050.02750.05950.08750.11450.1405测得未知蛋白溶液的A500为0.076；0.070，平均值为0.073。三．数据处理实验中蛋白浓度及其对应的吸光度值如下表：蛋白浓度/ug/ml0204080120160200A50000.01050.02750.05950.08750.11450.1405根据上表绘制标准曲线如下图-20020406080100120140160180200220-0.020.000.020.040.060.080.100.120.140.16A500蛋白浓度(ug/ml)A500LinearFitofA500软件拟合出的直线方程为：Y=7.17278E-4*X-6.73208E-4，R2=0.99803，说明拟合效果比较好。将未知蛋白溶液的A500平均值Y=0.073带入，计算得未知蛋白溶液的浓度为102.7ug/ml。四．注意事项及分析1.因为Folin试剂仅在酸性pH条件下稳定，但实验中还原反应只在pH=10的情况下发生，所以将Folin试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏前发生还原反应。2.添加蛋白溶液和试剂时尽量使用同一支移液枪，以减小误差。3.测量吸光度时按蛋白浓度递增的顺序进行测定，这样可略去洗涤比色皿的步骤。但测定未知蛋白溶液时要清洗并润洗比色皿。4.预测本实验得出的结果是偏低的，由于所用比色皿较大，没有多余溶液用来润洗，所以造成了一定程度的稀释，造成结果偏低。