第七章 酶工程制药

第七章酶工程制药第一节概述第二节酶和细胞的固定化第三节固定化酶和固定化细胞的反应器第四节酶工程研究的进展第五节酶工程在医药工业中的应用第一节概述一、酶的特性酶是生物催化剂，大多数酶的本质是蛋白质，有些酶是核酸。酶是由活细胞产生的具有特殊催化功能的一类蛋白质。其特点：①催化效率高；②专一性强；③反应条件温和；④催化活性受到调节和控制。酶由国际酶学委员会分为六大类：氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类、合成酶类。二、酶工程简介酶工程是酶学和工程学相互渗透结合发展而形成一门新的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异性催化功能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。20世纪20年代初出现，当时主要是自然酶制剂在工业上的大规模应用，1953年提出固定化酶技术，1969年利用该技术成功拆分了混旋氨基酸。1971年第一届国际酶工程会议提出的酶工程主要内容是：酶的生产、分离、纯化、固定化、固定化的反应器、酶与固定化酶的应用。现代酶工程的主要研究内容：（1）酶的分离、提纯、大批量生产及应用开发。（2）酶和细胞的固定化及酶反应器的研究（包括酶传感器、反应检测等）。（3）酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶（突变酶）的研究。（4）酶的分子改造与化学修饰以及酶的结构与功能之间关系的研究。（5）有机相中酶反应的研究。（6）酶的抑制剂、激活剂的开发及应用研究。（7）抗体酶、核酸酶的研究。（8）模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成的研究。酶工程优点：工艺简单、效率高、生产成本低、环境污染小、产品收率高、纯度高。三、酶的来源动物、植物、微生物，直接从生物体中分离提纯。化学合成方法目前还不成熟。早期是以动植物为原料进行提取，由于动植物生长周期长、来源有限、受地理、气候和季节等因素的影响，不适于大规模生产。目前的工业生产一般都以微生物为主要来源，工业上应用的酶大多采用微生物发酵法来生产。微生物生产酶制剂的优点：（1）种类繁多，酶的品种齐全。（2）生长繁殖快，生产周期短、产量高。（3）培养方法简单，原料来源丰富，价格低，效益高，并可通过控制培养条件来提高酶的产量。（4）有较强的适应性和应变能力，可以通过各种遗传手段，培育出新的高产菌株。四、酶的生产菌1、对菌种的要求产酶量高，酶的性能符合使用要求，最好是胞外酶；不是致病菌、在系统发育上与病源体无关，不产生毒素；稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体；能利用廉价原料，发酵周期短，易于培养。2、生产菌的来源菌种保藏机构、有关研究部门；从自然界中分离筛选：土壤、深海、温泉、火山、森林都是菌种采集地。筛选包括菌样采集、菌种分离、初筛、纯化、复筛、生产性能鉴定。生产菌的改良：基因突变、基因转移、基因克隆。3、目前常用的产酶微生物（1）大肠杆菌：一般属于胞内酶，需要经过细胞破碎才能得到。谷氨酸脱羧酶，用于测定谷氨酸含量或γ-氨基丁酸；天冬氨酸酶，催化延胡索酸加氨生成L-天冬氨酸；苄青霉素酰化酶，生成新的半合成青霉素或头孢霉素；β-半乳糖苷酶，用于分解乳糖。（2）枯草杆菌：淀粉酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酯酶等。（3）啤酒酵母：转化酶、丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶等。（4）曲霉（黑曲霉和黄曲霉）：有胞外酶和胞内酶，糖化酶、酸性蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶、脂肪酶等。（5）米曲霉：糖化酶和蛋白酶，在传统的酒曲和酱油曲中得到广泛应用。（6）木霉：纤维素酶，含有较强的17α-羟化酶，常用于甾体转化。（7）青霉：产黄青霉用于生产葡萄糖氧化酶、青霉素酰化酶；橘青霉用于生产脂肪酶、葡萄糖氧化酶、凝乳蛋白酶。（8）根霉：糖化酶、α-淀粉酶、转化酶、酸性蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶，含有较强的11α-羟化酶，常用于甾体转化。。（9）链霉菌：葡萄糖异构酶、青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶，含有丰富的11α-羟化酶，可用于甾体转化。。（10）植物细胞：大蒜-超氧化物歧化酶、木瓜-木瓜蛋白酶、菠萝-菠萝蛋白酶。五、提高药用酶产量的措施1、添加诱导物诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添加适当的诱导物，可使产酶量显著提高。乳糖诱导β-半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶。诱导物可分为三种：酶的作用底物、酶的反应产物、酶的底物类似物。2、控制阻遏物浓度有些酶的合成受到阻遏物的阻遏作用，应设法解除阻遏作用来提高酶的产量。3、添加表面活性剂表面活性剂的离子型对细胞有毒害作用，只能使用非离子型表面活性剂，表面活性剂可聚集在细胞膜上，增加细胞通透性，有利于酶的分泌，可增加酶的产量。4、添加刺激剂在植物细胞培养生产次级代谢产物的过程中，添加某些刺激剂可显著提高次级代谢物的产量。真菌的细胞壁碎片或其有效成分、微生物胞外酶以及一些小分子物质。5、添加产酶促进剂植酸钙镁可使霉菌蛋白酶和橘青霉磷酸二酯酶的产量提高1-20倍。六、酶在医药领域的应用1、在疾病诊断方面的应用酶学诊断包括两个方面：一是根据体内原有酶活力的变化来诊断某些疾病，如利用谷丙转氨酶活力升高来诊断肝炎。二是用酶测定体液中某些物质的量诊断疾病，如利用葡萄糖氧化酶测定血糖含量，诊断糖尿病等。酶学诊断方法具有可靠、简单又快捷的特点，在临床诊断中已被广泛使用。2、在疾病治疗方面的应用医药方面使用的酶具有种类多、用量少和纯度高等特点。主要的医药用酶有：（1）蛋白酶：临床上使用最早、用途最广的药用酶之一。消化剂：用于治疗消化不良和食欲不振，使用时常常与淀粉酶、脂肪酶等一起制成复合酶制剂，以增加疗效，片剂，可口服。消炎剂：对各种炎症有很好的疗效，它能分解一些蛋白质和多肽，使炎症部位的坏死组织溶解，增加组织的通透性，抑制浮肿，促进病灶附近组织积液的排出并抑制肉芽的形成，可口服、外敷和肌肉注射。蛋白酶经组织注射可治疗高血压。（2）溶菌酶：具有抗菌、消炎、镇痛等作用。作用于细胞壁，使其受到破坏，而使病原菌、腐败性细菌等溶解死亡。（3）超氧化物岐化酶：抗氧化、抗辐射、抗衰老、保护机体的DNA、蛋白质和细胞膜免受超氧负离子的破坏。对红斑狼疮、皮肤炎、结肠炎、白内障、风湿性关节炎、氧中毒等疾病有显著疗效，对辐射有防护作用。（4）L-天冬酰胺酶：用于治疗白血病。（5）尿激酶：具有溶血栓的活性。（6）α-淀粉酶：消化药。（7）脂肪酶：消化剂。假单胞菌脂肪酶能分解血液中的低密度脂蛋白和乳糜微粒，可用于预防和治疗高血脂病。（8）右旋糖苷酶水解右旋糖苷生产小分子产物，对龋齿有显著的预防作用，可加到牙膏和淑口水中。（9）乳糖酶治疗乳糖缺乏症，有些人或婴儿肠道中缺乏乳糖酶，饮用含有乳糖的牛奶等食品时，由于不能分解乳糖，在肠道中，乳糖会因为细菌分解而产生有机酸，刺激肠道引起呕吐。（10）链激酶可催化纤维蛋白酶原，激活成纤维蛋白酶，将纤维蛋白水解，使血栓溶解。（11）其他相关酶制剂：如细胞色素c等。3、酶工程在制药工业中的应用利用酶的催化特性将前体转化为药物。主要应用有：（1）在抗生素类药物生产中的应用利用青霉素酰化酶制造半合成青霉素和头孢霉素的原料：6-氨基青霉烷酸。目前有固定化黄青霉细胞生产青霉素及头孢菌素前体物的最新工艺研究。（2）在有机酸类药物生产中的应用生产L-苹果酸（延胡索酸酶）、L-酒石酸、乳酸、葡萄糖酸、衣康酸等。（3）在氨基酸类药物生产中的应用利用L-酪氨酸酶制造多巴等。（4）在核苷酸类药物生产中的应用利用核苷磷酸化酶生产阿糖腺苷等。（5）在甾体类药物生产中的应用生产的药物有：氢化可的松、脱氢泼尼松等。（6）在维生素类药物生产中的应用肌醇、L-肉毒碱（胆碱酯酶）（7）其它方面利用蛋白酶和羧肽酶将猪胰岛素转化为人胰岛素等。4、在药物分析检测方面的应用用酶进行物质分析检测的方法统称酶法检测或酶法分析。酶法检测是以酶的专一性为基础、以酶作用后物质的变化为依据来进行的。根据酶反应的不同，酶法检测可以分成单酶反应、多酶偶联反应和酶标免疫反应三类。七、酶工程制药的基本技术1、酶和细胞的固定化技术2、酶的化学修饰技术3、酶法的手性药物合成技术使用纯酶的缺点：只能使用一次，成本高，产品分离困难；酶溶液很不稳定，容易变性和失活。固定化酶的优点：性能稳定；可反复使用，降低了成本，易与产品分离，简化下游操作。第二节酶和细胞的固定化一、固定化酶的制备1、固定化酶的定义：固定化酶是指限制或固定于特定空间位置的酶。具体是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。制备固定化酶的过程称为酶的固定化。2、固定化酶的特点具有生物催化剂的功能，又有固相催化剂的功能。固定化酶的优点：①可在较长时间内多次使用，在多数情况下，酶的稳定性提高。②反应后，酶底物产物易分开，产物中无残留酶，易于纯化，产品质量高。③反应条件易控制，可实现转化反应的连续化和自动控制。④酶的利用效率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量减少。⑤比水溶性酶更适合于多酶反应。固定化酶的缺点：①固定化时，酶活力有损失。②增加生产成本，工厂初始投资大。③只能用于可溶性底物，而且较适于小分子底物，对大分子底物不适宜。④胞内酶必须经过酶的分离纯化过程。⑤与完整菌体相比不适宜多酶反应，特别是需要辅助因子的反应。酶和细胞固定化方法载体结合法交联法包埋法网格型微囊型物理吸附法离子结合法共价结合法热处理（细胞）3、酶和细胞固定化方法（1）载体结合法①物理吸附法；②离子结合法；③共价结合法。（2）交联法（3）包埋法：①网格型；②微囊型（4）选择性热变性法：专用于细胞固定化，是将细胞在适当温度下处理，使细胞膜蛋白变性但不使酶变性而使酶固定于细胞内的方法。酶和细胞固定化模式4、酶和细胞的固定化载体（1）吸附载体：（物理吸附、离子吸附）矾土、膨润土、活性炭、氧化铝、纤维素、碳酸钙等。（2）包埋载体：卡拉胶、海藻胶等。（3）共价结合载体：纤维素、琼脂、聚丙烯酰胺等。5、固定化酶制备技术（1）吸附法制备固定化酶技术（2）包埋法制备固定化酶技术①界面沉降法；②界面聚合法（3）交联法制备固定化酶技术（4）共价结合法制备固定化酶技术二、固定化细胞的制备1、固定化细胞的定义将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。固定化细胞也称为第二代固定化酶。已发展到动植物细胞，甚至线粒体、叶绿素及微粒体等细胞器的固定化。2、固定化细胞的特点既有细胞特性，也有生物催化剂功能，又具有固相催化剂特点。其优点：①无须进行酶的分离纯化。②细胞保持酶的原始状态，酶回收率高。③细胞内酶比固定化酶稳定性更高。④细胞内酶的辅助因子可以自动再生。⑤细胞含多酶体系，可催化一系列反应。⑥抗污染能力强。固定化细胞的缺点：（1）利用的仅是胞内酶，而细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副产物。（2）细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用。（3）载体形成的空隙大小影响分子底物的通透性。固定化细胞具有固定化酶的特点外，还有自身的优点，应用更为普遍。工业上已应用的固定化细胞有很多种，如固定化E.coli生产L-天冬氨酸或6-氨基青霉烷酸、固定化黄色短杆菌生产L-苹果酸、固定化假单胞菌生产L-丙氨酸等。3、固定化细胞的制备技术细胞的固定化主要适用于胞内酶，要求底物和产物容易透过细胞膜，细胞内不存在产物分解系统及其他副反应，若存在副反应，应具有相应的消除措施。（1）载体结合法是将细胞悬液直接与水不溶性的载体相结合的固定化方法。载体：阴离子交换树脂、阴离子交换纤维素、多孔砖及聚氯乙烯等。（2）包埋法：最常用方法将细胞定位于凝胶网格内的技术。载体有卡拉胶、聚氯乙烯、琼脂、明胶及海藻胶等。（3）交联法：用多功能试剂对细胞进行交联的固定化方法。所用化学试剂对细胞有毒性，应用较少。（4）无载体法靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。本法是通过助凝剂或选择性热变性的方法实现细胞的固定化。如含葡萄糖异构酶的链霉菌细胞，经柠檬酸处理，使酶保留在细胞内，再加絮凝剂脱乙酰甲壳素，获得的菌体干燥后即为固定化细胞。三、固定化方法与载体的选择依据1、固定化方法的选择选择固定化方法时应考虑的因素（1）固定化酶应用的安全性（2）固定化酶在操作中的稳