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实验三细菌形态结构观察与革兰染色实验目的１掌握细菌的基本形态及特殊结构2掌握革兰染色的原理、方法、结果3掌握油镜的使用原理及使用方法实验原理G染色原理：等电点学说化学学说通透性学说实验用品1、菌种培养24h的葡萄球菌、大肠杆菌。2、染液革兰氏染液草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、稀释石炭酸复红染液。3、其他物品接种环、吸水纸、酒精灯、载玻片、显微镜、香柏油、擦镜纸、细菌标本片等。实验内容细菌的基本形态、特殊结构（示教）细菌的G染色（操作，6人/组）病原生物学实验室守则1、学生进实验室应穿好实验室专用隔离衣；与实验无关物品不准带入实验室，所有实验材料严禁带出实验室。2、实验室内禁止吸烟及饮食。3、严格操作规程，杜绝生物安全事故。污染标本及使用过的有菌器材放于指定的消毒缸内，统一进行消毒处理。需要培养的物品做好标记，放于指定培养箱内。4、如在实验过程中发生有菌材料溅出、污染环境或化学药品灼伤等意外情况，应立即报告老师，以便及时处理。5、爱护仪器设备，不经老师批准，不准自行接通、断开电源或拆卸仪器。对仪器设备造成人为损坏的，要酌情赔偿。实验结束后，仪器设备状态复原。6、实验结束后，清洁台面、所有循环使用器材复原；安排值日生打扫卫生；检查水、电、门、窗等设施，并经实验室负责人检查认可。7、用肥皂或消毒液洗手、脱隔离衣后方可离开实验室。一、细菌基本形态、特殊结构观察（一）、细菌基本形态观察1.球菌：G+：葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌G-：淋球菌2.杆菌：大肠杆菌（G-）3.螺形菌：霍乱弧菌（G-）葡萄球菌链球菌G+球菌：肺炎球菌G+球菌：痰液中的肺炎链球菌（革兰染色，×1000）肺炎链球菌电镜图G-球菌：淋球菌大肠埃希菌G-杆菌：霍乱弧菌G-弧菌：（二）、细菌特殊结构观察1.荚膜：肺炎球菌2.鞭毛：变形杆菌（周鞭毛）、霍乱弧菌（单鞭毛）3.芽胞：破伤风杆菌（顶端）、炭疽杆菌（中部）概念:某些细菌在其细胞壁外包绕一层粘液性物质生物学意义:1.保护细菌，与细菌致病性有关2.用于细菌的鉴别与分型肺炎链球菌荚膜荚膜荚膜：肺炎链球菌荚膜：概念：许多细菌在菌体上附有细长并呈波状弯曲的丝状物生物学意义1.鞭毛是运动器官。有鞭毛的细菌能主动运动，可通过动力试验进行细菌鉴定。2.有的细菌其鞭毛与致病性有关。3.可作为细菌分类、分型的依据。鞭毛：变形杆菌（周鞭毛）鞭毛鞭毛：霍乱弧菌（单鞭毛）概念:某些细菌在一定的环境条件下，能在菌体内部形成一个圆形或卵圆形小体，是细菌的休眠形式。生物学意义1.芽胞抵抗力强，故应以杀灭芽胞作为可靠的灭菌指标。高压蒸汽灭菌法是杀灭芽孢最有效的方法。2.芽胞的抵抗力强，可在自然界中存在多年，是重要的传染源。但芽胞并不直接引起疾病，只有发芽成为繁殖体后，才能迅速大量繁殖而致病。3.鉴别细菌每种细菌形成一种类型芽胞芽孢：芽胞的大小、形状、位置等随菌种而异，有重要的鉴别意义炭疽芽胞杆菌肉毒梭菌破伤风杆菌二、革兰染色法革兰染色法是细菌学中最广泛使用的一种鉴别染色法。由丹麦医师ChristianGram创立。方法是先将细菌用结晶紫染色，加媒染剂（增加染料和细胞的亲和力）媒染后，用脱色剂（乙醇）脱色，再用复染剂染色。G+菌G-菌一一半半结晶紫卢戈氏碘液95%乙醇石碳酸复红初染媒染脱色复染（一）、革兰染色原理G+菌G-菌等电点学说PI2~3PI4~5带负电荷多带负电荷少化学学说含核糖核酸镁盐多含核糖核酸镁盐少通透性学说低高肽聚糖多，脂质少肽聚糖少，脂质多酒精不易进入酒精易进入（二）、G染色步骤与方法1、涂片制备涂片干燥固定2、染色初染（结晶紫）1min媒染（卢戈氏碘液）1min脱色（95%乙醇）30s复染（石碳酸复红）30s吸水纸吸干3、镜检（油镜下观察）每次染色后都要进行冲洗时间：一、一、半、半葡萄球菌大肠杆菌（三）、G染色结果革兰氏阳性革兰氏阴性（四）、革兰染色注意事项涂片要均匀，不可太厚干燥时切勿在火焰上直烤染色时脱色最关键细流水冲洗，不要直冲涂膜涂片上积水不能太多，以免稀释染液（五）、革兰染色的意义1、鉴别细菌通过染色将细菌分为G+、G-两大类细菌2、研究与致病性的关系G+菌致病一般为外毒素G-菌致病一般为内毒素3、指导临床用药G+菌对青霉素、红霉素、头孢菌素敏感G-菌对上述药物不敏感，对链霉素、氯霉素、庆大霉素、卡那霉素等敏感（一）油镜工作原理油镜的透镜非常小。在不加油的情况下，由于空气和玻璃对光线的折射率不同，因此光线透过载玻片经过空气时发生散射，很少能够进入油镜，造成物像不清。香柏油（n=1.515）的折光率与玻璃（n=1.52）相近，由于光线透入时不会因折射而减弱，因此视野明亮，物像清晰。三、显微镜油镜的使用目镜物镜载物台集光器光源镜臂粗螺旋细螺旋（二）油镜使用方法1．对光接通电源，打开显微镜上的电源开关，内置光源灯亮，并可调节亮度。使用油镜时，应将灯光调至最亮，聚光器升至最高，光栅完全打开。2．标本加油在细菌染色片的菌膜上滴加1滴香柏油，注意勿使载物台倾斜，以免镜油流淌。3．识别并转换油镜头油镜有三种标志：①放大倍数×100；②镜头下缘有一圈白线；③英文标识“oil”。找到油镜，旋转物镜转换器（勿用手直接掰动镜头）使油镜头转至载物台中央。4．调焦、观察标本从侧面观察并缓慢转动粗调螺旋，使载物台上升至油镜头浸入油中并几乎与玻片接触（注意勿使两者相碰）时为止；眼睛转向目镜观察视野，并往相反方向转动粗调螺旋缓慢下降载物台，至视野中闪现标本轮廓时为止；再转换细调螺旋调节至物像清晰。若直至油镜头脱离油滴仍未看到物象，可重复以上操作。（三）油镜使用注意事项显微镜属于精密仪器，使用时需仔细小心、避免震动。调焦时切忌用力过猛、一味往一个方向调节，否则易损坏镜头或压碎标本片。油镜头用后应下降载物台，取下标本，立即用擦镜纸顺一个方向擦净镜头上的油。若油已干，可在擦镜纸上滴少许二甲苯擦拭，并随即用干净的擦镜纸擦去二甲苯，以防止腐蚀镜头。标本片上、下面不要放反；看完后一定放回标本盒，不要放入消毒桶内。显微镜用后应旋转物镜转换器，将物镜转成“八”字形，以避免各镜头直接对着集光器，发生意外碰撞损坏镜头；降下聚光器，关闭光栅，套上防尘套。显微镜应放在背阴干燥外，以防透镜生霉。思考题1、革兰染色的关键步骤是什么？脱色2、革兰染色是重要的细菌鉴别染色之一，复染的作用是什么？使脱色菌体着色，并与初染形成鲜明对比3、在光镜下能看到的细菌特殊结构有哪些？作业1、绘出细菌的三种基本形态及特殊结构，并注明名称及放大倍数。2、记录染色结果并分析