DNA测序仪的原理及应用

DNA测序仪的原理及应用上海交通大学分析测试中心侯敬丽内容•DNA测序原理•CEQ8000DNA测序仪•基因测序系统的应用–基因组DNA:染色体–质粒DNA:细菌细胞–线粒体DNA:胞浆–人工染色体DNA:BACYAC–cDNA引双脱氧链末端终止法1977年，Sanger等人发展建立起来的一种DNA测序方法。基本原理：双脱氧链末端终止法通过使用链终止剂—类似于正常dNTP的2’,3’-双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，将延伸的DNA链特异性地终止。其反应体系也包括单链模板、引物、4种dNTP和DNA聚合酶。共分四组，每组按一定比例加入一种(ddNTP)，它能随机渗入合成的DNA链，一旦渗入合成即终止，于是各种不同大小片段的末端核苷酸必定为该种核苷酸，可以从放射自显影带上直接阅读DNA的核苷酸序列。双脱氧链末端终止法测序基本原理示意双脱氧链末端终止法特点双脱氧链末端终止法不仅具有化学测序法的优点，而且更适用于大规模的测序。但它要求有一个纯净的单链DNA模板和一个合成反应所需的特异性的引物。因此，早期的工作仅局限于单链噬菌体为模板，若干个不同的特定限制性内切酶酶解片段为引物，在模板链的不同部位引导合成，从而确定出噬菌体DNA的核酸序列。然而，对于大量存在着的天然双链DNA分子，因没有良好的制备产量和质量高的分离链的技术，而限制了双脱氧链末端终止法的应用程度。经典的双脱氧链末端终止法测序技术的改进标记物方面的改进：由于放射性同位素对人体的危害，许多实验室开始利用非放射性物质来取代放射性同位素。如生物素、地高辛、银染法、荧光标记物等化学发光物。在双脱氧法测序时，它们作为标记物，示踪测序反应的产物，昀后通过酶显色反应或者荧光信号显示出测序的结果。这些方法比传统的放射性同位素方法检测容易、安全、快速、费用也低。经典的双脱氧链末端终止法测序技术的改进电泳方法的改进:电泳方法的改进主要采用毛细管电泳法。毛细管电泳是被分离物质在毛细管中的电泳。1992年，Matnies等首先提出陈列毛细管电泳法，采用激光聚焦荧光扫描检测装置。25只毛细管并列电泳，每只毛细管在1.5小时内可读出350bp。DNA序列分析效率可达6000bp/h。双脱氧链末端终止法测序基本原理示意DNA测序仪测序原理SangerDNA测序仪的发展历程™1977:SangerDNA法测序概念被提出™1986:HoodandSmith荧光标记ddNTP被用于电泳™1987:第一台自动测序仪产生™1990:毛细管电泳被应用在DNA测序上™2003:人类基因组测序工作完成GATCCCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCCEQ8000DNA测序仪CEQ8000DNA测序仪硬件预览CapillaryArrayDiodelasersDetectionwindowFilterwheelPMTGelCartridge+AutomatedSampleDenaturationandInjectionBeckmanCEQ8000StartmenuAlignmentAnalyzedDataQualityParametersBaseSequenceRawDataCurrentVoltageViewaSEQResultViewaSEQResult质粒和PCR产物测序仪器性能•CEQ基因分析系统是一个全自动的系统，能够测定经过BeckmanCoulter染料标记试剂处理的DNA样品的碱基序列和片段长度。四色染料标记终止反应试剂盒用于对样品进行碱基序列分析。染料标记引物则用于对样品产生的片段长度进行分析。•CEQ8000可一次接受1个96孔板。包括标记DNA片段的每排8个样品（样品设置）自动变性，接着被毛细管电泳分离。每次分离之后，在8根毛细管中的可替换媒介（分离胶）都被自动替换。分离胶是由一个容易替换的胶管供给的，它能有效的供应1块96孔板。•检测是在四个光谱信号中由激光诱导的荧光决定的。分离之后，8根毛细管中的每根产生的原始数据信号都自动处理产生高质量的碱基序列或片段序列。原始数据和分析数据储存在数据库里，都能够以与普通分析应用程序兼容的格式输出。1.分离纯化模板DNA*2.DNA模板定量分析*3.测序反应*4.测序反应后纯化*5.On-line变性*6.毛细管电泳和检测*7.数据分析*测序过程:DNASequencingwithGenomeLabTM测序过程:DNASequencingwithGenomeLabTM分离纯化模板DNA•1)应用质粒提取试剂盒或者切胶纯化的方法得到相应的质粒模板或者PCR产物；•2)将DNA储存在灭菌水里如ddH2O,18.2MΩH2O超纯水；注意：不要使用DEPC处理的水，水中不能有EDTA，否则将抑制测序反应•3)通过紫外分光光度计定量DNA模板，DNA模板的浓度应该0.1ug/ul；•4)通过琼脂糖凝胶电泳检查DNA模板的质量。准确定量DNA模板是测序反应中十分重要的一步测序反应测序反应后纯化测序反应后纯化去掉反应产物中的dNTP,ddNTP和盐分•乙醇沉淀(利用96孔板离心机）GCGCTAMg++Mg++Mg++Mg++Mg++Mg++GCATTAATAT纯化得到DNA测序反应产物测序反应后纯化•激光诱导的荧光终止剂被检测器识别，直接阅读DNA的核苷酸序列DNA测序仪检测•荧光标记的DNA链按从小到大的顺序被毛细管电泳分离。StandardKit–SequencingReactionBuffer–dNTPMix–ddUTP,ddGTP,ddCTP,ddATPDyeTerminators–PolymeraseEnzyme–SampleLoadingSoln(SLS)DTCSKits…(Storeat–20°C)QuickStartKit–Everythingmixed(ExceptSLS)–Savetime,cost–Eliminatewastefromcarry-overTypicalSequencingResult基因测序系统的应用9测序‹PCR克隆测序验证‹突变体检测‹新基因测序‹全基因组测序‹系统发育及物种鉴定‹个体识别：亲缘鉴定‹SNP关联分析‹疾病诊断等9片段分离PCR克隆测序验证突变体检测新基因测序BAC克隆或YAC克隆去筛选cDNA文库找出候选基因精确定位法检查cDNA是否与目标基因共分离测定cDNA序列，查询数据库，以了解该基因的功能检查cDNA时空表达特点是否与表型一致筛选突变体文库，找出DNA序列上的变化及与功能的关系进行功能互补实验，通过转化突变体观察突变体表型是否恢复正常或发生预期的表型变化图位克隆法分离新基因全基因组测序z细菌、DNA病毒、Cosmid、Plasmid、微生物1000多种病毒、135种细菌、16种古细菌的测序已经基本完成z动物、植物基因组动物:人类，老鼠，果蝇、丝盘虫、甲虫等　　　植物：拟南芥、水稻、毛果杨、大豆　　　　　　　　　　基于线粒体COI基因部分序列构建梭子蟹系统发育树，研究各种梭子蟹系统发育和亲缘关系，并且对样品蟹的种类进行鉴定。系统发育及物种鉴定MarineSciences，2008，Vo1．32，No．4，9AGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCUpto1000Repeats2-10bases短串联重复：ShortTandemRepeat(STR)简单序列重复：SimpleSequenceRepeat(SSR)可变数目串联重复：Variable-numberTandemRepeat(VNTR)微卫星序列：MicrosatelliteInallgenomes•Human•Animals•Plants•MicrobesSTR/SSR/VNTR/Microsatellite个体识别：亲缘鉴定PCRCEQPCRCEQAnalysisofSTR/SSR/MicrosatelliteHeterozygote(Person1)Homozygote(Person2)PCRCEQPCRCEQSTR微卫星标记的片断分析HumanSTRPrimerKitSingleNucleotidePolymorphism(SNP)SNP关联分析单核苷酸多态性：碱基插入、缺失、突变等原因造成PrimerExtensionTechnology:TheGenotypingGoldStandardDetectfunctionAnneal:SimplePrimerExtensionExtend:Accurate“lockandkey”enzymeDetect:FluorescencePrimerExtensionTechnologyATTA123ACT/AATCGTASNP1SNP3SNP2SNP检测策略Allele2+Allele2===GTAGGAGGACAGATAAAGAAGC===Allele2:===GTAGGGGGACAGATAAAGAAGC===Allele1:Person1Person2Person3Allele1+Allele1Allele1+Allele2HomozygoteHeterozygoteHomozygoustemplateHeterozygoustemplateMicrosatelliteInstability(MSIorMI)inCancerDifferentTissuesfromtheSamePatientinTumortissueinNormaltissue疾病诊断PCRCEQLossofHeterozygosity(LOH)inCancerPCRCEQPCRCEQHeterozygote–inNormaltissueNon-Heterozygote–inTumortissueDifferentTissuesfromtheSamePatient疾病诊断总结•SangerDNA测序原理•BeckmanDNA测序仪构造•DNA测序仪样品前处理过程-测序反应•DNA测序仪应用谢谢！