王--实验二 土壤中微生物的分离与纯化

实验二土壤中微生物的分离与纯化实验目的l．掌握常用的分离纯化微生物的方法。2．了解微生物常用的接种和培养方法，熟练掌握斜面接种的方法和技术3．学习倒平板的方法，进一步掌握无菌操作技术实验原理从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。土壤中混杂着大量的微生物,是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。本实验将采用不同的培养基，通过稀释涂布平板法和平板划线法，从土壤中分离不同类型的微生物。微生物的分离技术稀释涂布平板法平板划线分离法简易单孢子分离法菌落（colony）单个微生物在适宜固体培养基表面或内部生长繁殖到一定程度,形成肉眼可见有一定形态结构的子细胞的群落。微生物培养技术斜面接种液体培养基接种穿刺接种实验器材实验材料:菌源:土样10g、大肠杆菌、金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、四联球菌、黑曲霉菌、青霉菌、放线菌、牛肉膏蛋白胨培养基、马丁氏培养基、高氏一号培养基等试剂:10%酚、链霉素、工业酒精实验仪器:盛9mL无菌水的试管、涂布器、1-2ml无菌吸管、0.1-0.2ml无菌吸管、接种环，酒精灯、无菌培养皿、试管架、培养箱、超净工作台、记号笔、废液缸实验方法及步骤微生物的分离一、稀释涂布分离法1.倒平板：牛肉膏蛋白胨，高氏I号，马丁氏培养基加热溶解后冷却至55-60℃时，分别向高氏I号培养基中加入数滴10%的酚，向马丁氏培养基中加入3ml/1000ml的链霉素，混匀后倒平板，牛肉膏蛋白胨倒4皿、高氏I号和马丁氏培养基各倒3皿。2.土壤稀释液的制备：10g土样，加入90ml无菌水中，在三角瓶中振摇10~20min，即成为稀释度为10-1的土壤悬液。取0.5ml加入盛有4.5ml无菌水的试管中，以此类推，分别制成稀释度为10-2~10-6的土壤悬液。3.涂布：将上述每种培养基平板底面标记稀释度，然后用无菌吸管从最后三种稀释度，即10-4、10-5和10-6的试管中吸取0.1ml对号放入平板上，用玻棒涂布。4.培养：高氏I号和马丁氏倒置培养于28℃培养箱中培养3-5d，牛肉膏蛋白胨培养基在37℃培养1-2d。5.挑菌落：转至斜面，检查是否一致，保存。1.倒平板，标记培养基名称、编号和日期。2.划线方法3.挑单菌落二、平板划线分离法斜面接种：由已长好微生物的斜面中挑取少量菌种接种至另一空白斜面培养基上。1.接种前用记号笔在距试管口2－3cm位置上，注明菌名、接种日期等。2.将试管放于手掌中，并用手指夹住，使两支试管呈“V”字形。3.用火焰将接种环烧红，然后将接种环来回通过火焰数次。4.用小指、无名指和手掌拔下试管塞，并持于手中。5.将试管口在火焰上微烧一周。6.将烧过的接种环伸入菌种管内，先将环接触一下没有长菌的培养基部分，使其冷却，以免烫死菌体，然后用环在菌苔上轻轻地接触，刮下少许培养物，并将接种环慢慢的从试管中抽出，并迅速地伸入另一试管中，在斜面上划线（波浪或直线），使菌体沾附在培养基上。7.将接种环抽出，灼烧管口。8.塞上棉塞。9.将接种环经火焰灼烧灭菌。微生物接种培养结果与观察：2.绘出平板上出现的菌落的生长和分布情况。3.观察与记录以下内容：序号来源大小形状边缘颜色表面代谢物种类培养物生长情况（+或-）染菌情况（+或-）牛肉膏10-4牛肉膏10-5……1.检查接种后培养物的生长情况和染菌情况，将实验结果填入下表注意事项1.无菌操作前需对超净工作台进行灭菌（紫外灯、无菌风、酒精消毒）2.接种环要灼烧灭菌，灭菌后放入菌液或要接触菌体前要冷却，接种后要在火焰上将多余的菌种烧死。3.实验操作时菌体不应和火焰太过接近，防止烧死菌体和烧着棉塞。4.培养时要倒置培养，防止染菌。5.取单菌落时不要碰到其它的菌落。6.本实验要严格的按照无菌操作进行。