转座子的插入突变及转座子的应用

转座子的插入突变及转座子的应用主讲人:巴金娇周振宇内容提要一、转座子的发现二、转座子的分类三、转座子的转座机制四、转座子的应用一、转座子的发现转座子（transponson,简称Tn）,又称易位子，是指存在于染色体DNA上可以自主复制和位移的一段DNA序列。转座子可以在不同复制子之间转移，以非正常重组方式从一个位点插入到另外一个位点，对新位点基因的结构与表达产生多种遗传效应。一、转座子的发现•转座子是1951年美国玉米遗传育种学家Mcclintock最早发现的，是针对玉米籽粒中色斑不稳定现象而提出来的。•当时这是一个新概念，它突破了以往人们认为基因在染色体上的位置是固定不变的认识，所以一开始并不被大家接受，直到1967年在大肠杆菌(E．coli)的半乳糖操纵子研究中发现了这类插入序列，才得以被普遍认同。一、转座子的发现•现在的研究说明，在生物界中转座子是普遍存在的，并认为在生物的遗传进化方面有重要作用。转座子从一个位置转座到另一个位置的转入和切出过程，改变了原有基因的结构和排序，从而产生了突变。•目前生物体中所发现的10％的突变是由于它抑制其他基因的表达而形成的。二、转座子的分类（一）简单转座子（插入序列，IS）结构特征：1、含短的末端反向重复序列（15-25bp）;2、含编码转座酶的基因;3、靶位点存在5-9bp的短正向重复序列。二、转座子的分类（二）复合转座子结构特征：(1)中间区域含编码转座酶以外的标记基因；(2)两端具有插入序列；(3)两末端是反向重复序列；(4)靶位点存在短正向重复序列。三、转座子的转座机制据转座子的移动机制，转座可分为：（一）复制型转座（二）非复制型转座（一）非复制型转座特征1、断裂和重接反应使靶重构。2、供体保持裂缺。3、不形成共整合体。转座酶结合在Tn两端转座子末端被交错剪切+另一条链也被切受体也被交错切割图23-42交换结构经剪切释放供体被释放Tn连接到靶上后导致非复制型转座子插入到靶DNA中，DR包在两侧，供体留下了一个双链缺口。图23-43Tn的两条链先后被切割，然后转座子与切开的靶位点连接。（二）复制型转座特征：1、转座后原来位置上的转座因子保持不变；2、转座过程中有一共整合体。Tn从3’末端复制产生共合体靶单链交错切割共合体重组转座子被切开的末端和靶被切开的末端连接交叉结构(单链转移复合图23－41转座模型。Mu转座产生交换结构，此结构通过复制产生共合体，共合体中的转座子之间发生交换产生2个重组子。四、转座子的应用基因的标定构建突变体库鉴别菌株及群体多样性生态环境污染的生物修复转基因生物的克隆1、基因的标定所要分离和克隆的基因不同，在定位和标定时所用的方法也不同。若要获得感兴趣的己知目的基因，则采用目的诱变策略，即用一个稳定遗传的隐性纯合体与一个带有活跃转座子的显性纯合体杂交，可以在F1代标定目的基因。1、基因的标定若要获得引起新突变的未知基因，则用随机诱变策略(非目的诱变)，即将带有功能性转座因子的显性纯合系植株与不带转座因子的同种植株杂交，产生的F1子代再自交，在F2代中就可筛选到转座子随机插人引起突变表型的突变株，然后选择感兴趣的新突变株进行研究。2、构建突变体库转座子具有可选择的抗性标记而容易在体内鉴定突变，经转座子诱变的突变子含有已知的DNA片段，可以通过转座子序列的杂交来鉴定突变基因的位置，经转座子诱变的突变体具有高度的极性，使得被诱变的基因以及同一操纵子内的下游基因完全丧失功能。2、构建突变体库正因为以上转座子的特征，转座子才被广泛应用于构建插入突变体库，现已成为研究基因功能的重要手段之一。目前研究和应用得较多的有Tn10、Tn5、Tn3和Mu噬菌体。3、鉴别菌株及群体多样性转座子通常限制性地分布于特定的真菌菌株或群体中，可以作为特定菌株的诊断工具，已用于丝状真菌群体多样性分析。在医药工业方面已用于有益菌株的鉴别，在植物病理学方面已用于鉴别特定的病原。4、生态环境污染的生物修复由于基因的可变性及转座子的遗传调控，许多微生物能够利用人工合成的化学物质，与微生物分解代谢相关的基因往往与插入元件相连。当环境污染时，转座子转移频率提高，增加了微生物种群的生物降解潜力。5、转基因生物的克隆在细胞工程中，转座子可作为有力的工具和基因载体系统用于克隆转基因生物。基因组插入质粒P因子已成功克隆转基因果蝇。通常认为，转座子的插入能引起新的突变体形成，但其副作用也许会抵消由转基因提供的任何优势，以可移动DNA片段作为载体尚存在转移基因结果的不稳定现象和内源跳跃基因的相互影响。因此，这方面的应用还处于探索阶段。