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Ambiontrizol中文说明书TRIzolReagentCatalogNumbersQuantityStoreat2℃to25℃15596-026100mL15596-018200mL介绍TRIzol®试剂是一种即用型试剂，用于在一小时内从人，动物，植物，酵母或细菌来源的细胞和组织样品中分离出高质量的总RNA（以及DNA和蛋白质）。TRIzol®试剂是苯酚，异硫氰酸胍和其他专有成分的单相溶液，有助于分离大小分子大小的各种RNA物质。TRIzol®试剂由于高效抑制RNase活性而保持RNA的完整性，同时破碎细胞并在样品均质化过程中溶解细胞成分。TRIzol®试剂允许同时处理大量样品，并且是由Chomcynski和Sacchi开发的单步RNA分离方法的改进（Chomczynski＆Sacchi，1987）。TRIzol®试剂允许用户从单个样品中顺序沉淀RNA，DNA和蛋白质（Chomczynski，1993）。在用TRIzol®试剂均质化样品后，加入氯仿，使匀浆分离成透明的上层（含RNA），相间和红色较低的有机层（含有DNA和蛋白质）。用异丙醇从水层中沉淀出RNA。用乙醇从相间/有机层沉淀出DNA。蛋白质通过异丙醇沉淀从酚-乙醇上清液中沉淀。将沉淀的RNA，DNA或蛋白质洗涤以除去杂质，然后重悬浮以用于下游应用。分离的RNA可用于RT-PCR，Northern印迹分析，点印迹杂交，poly（A）+选择，体外翻译，RNA酶保护测定和分子克隆。分离的DNA可用于PCR，限制酶消化和SouthernBlots。分离的蛋白质可用于Western印迹，回收一些酶活性和一些免疫沉淀。警告TRIzol®试剂含有苯酚（有毒和腐蚀性）和异硫氰酸胍（刺激物），如果处理不当，可能会对健康构成危害。始终与通风柜中的TRIzol®Reagent一起使用，并始终穿上实验室外套，手套和安全眼镜。请联系您的环境健康与安全（EH＆S）部门以获得正确的工作和处置指南。避免与TRIzol®试剂直接接触，因为接触皮肤，眼睛或呼吸道可能导致暴露部位的化学灼伤。如果接触到皮肤或眼睛，立即用大量的水冲洗暴露的区域15分钟，并在必要时就医。如果吸入蒸气，必要时移动新鲜空气并寻求医疗救护。有关更多信息，请参阅我们网站上的TRIzol®试剂SDS（安全数据表）。内容和存储TRIzol®试剂以100mL（目录号15596-026）或200mL（Cat。no。15596-018）体积供应，并在室温下运输。收到后，将TRIzol®试剂储存在室温下。妥当储存时，TRIzol®试剂稳定12个月。使用范围仅供研究使用。不适用于人或动物的诊断或治疗用途。所需材料需要以下附加材料，但不提供用于分离RNA，DNA或蛋白质。分离RNA分离DNA分离蛋白质氯仿异丙醇75％乙醇（在DEPC处理过的水中）无RNase的水或0.5％SDS离心机和转子能够达到12,000×g聚丙烯微量离心管水浴或热块（55-60℃）氯仿100％乙醇75％乙醇0.1M柠檬酸钠在10％乙醇中8mMNaOH离心机和转子能够达到12,000×g聚丙烯微量离心管氯仿异丙醇100％乙醇在95％乙醇中0.3M盐酸胍1％SDS离心机和转子能够达到12,000×g聚丙烯微量离心管准备样品均质样品1、确定样品类型，并按照下表在室温下进行均质化。样品体积不应超过用于均质化的TRIzol®试剂的体积的10％。确保使用指定量的TRIzol®试剂，因为体积不足可导致分离的RNA的DNA污染。样本类型步骤组织1.每50-100毫克组织样品加入1毫升TRIzol®试剂。2.使用glassTeflon或均质器均匀化样品。注意：收集后立即加工或冻结组织样品。粘附细胞（单层）从培养皿中取出生长培养基。2.每10cm2培养皿表面积，将1mLTRIzol®试剂直接加入培养皿中的细胞。注意：添加1mLTRIzol®试剂，用于35mm培养皿，3mL用于60mm培养皿，8mL用于100mm培养皿。3.通过将细胞上下移动数次，直接在培养皿中溶解细胞。悬浮细胞1.通过离心收集细胞并除去培养基。2.每0.25mL样品（来自动物，植物或酵母来源的5-10×106个细胞或细菌来源的1×107个细胞）加入0.75mLTRIzol®试剂。注意：添加TRIzol®试剂前不要洗涤细胞，以避免增加mRNA降解的几率。3.通过上下移动数次将样品中的细胞溶解。一些酵母和细菌细胞的破坏可能需要使用均化器。2、（可选）当制备具有高含量脂肪，蛋白质，多糖或细胞外物质（例如肌肉，脂肪组织或块茎植物材料）的样品时，可能需要额外的分离步骤以从样品中除去不溶性物质。注意：如果您对样品进行后续的DNA分离，请勿执行此额外的隔离步骤。样品类型步骤具有高脂肪，蛋白质，多糖或细胞外物质含量的组织或细胞1.匀化后，在4℃下以12,000×g离心10分钟。注意：所得颗粒含有ECM，多糖和高分子量DNA，而上清液含有RNA。在高脂肪含量的样品中，一层脂肪收集在上清液上方。2.取出并丢弃脂肪层。3.将清除的上清液转移到新管中。3、进行相分离，或储存均质样品。均质样品可以在室温下储存几个小时，或在-60至-70℃保存至少一个月。相分离1.均匀化样品（见均质化样品）在室温下孵育5分钟以允许核蛋白复合物完全解离。2.每1mL用于匀浆的TRIzol®试剂加入0.2mL氯仿。牢固地盖住管子。3.用手摇动管15秒钟。4.室温孵育2-3分钟。5.在4℃下以12,000×g离心15分钟。注意：该混合物分成：较低的红色苯酚氯仿相，中部和无色的上部水相。RNA完全在水相中。上部水相为总体积的约50％。6.以45°倾斜管取出样品的水相，并将溶液移出。在吸取水相时，避免将任何相间或有机层吸入移液管。7.将水相置于新管中，并进行RNA分离步骤。8.如果需要分离DNA或蛋白质，可以节省中间层和有机酚-氯仿相。有关详细信息，请参阅DNA分离程序和蛋白质分离程序。有机相可以在4℃下储存过夜。RNA分离步骤在准备和处理RNA时，请务必采取适当的预防措施以避免RNA酶的污染。RNA沉淀1.（可选）当从小量样品（106个细胞或10毫克组织）中沉淀出RNA时，加入5-10微克无RNA酶的糖原作为载体的水相。注意：糖原与RNA共沉淀，但不抑制浓度≤4mg/mL的第一链合成，不抑制PCR。2.每1mL用于匀浆的TRIzol®试剂，向水相中加入0.5mL的100％异丙醇。3.在室温下孵育10分钟。4.在4℃下以12,000×g离心10分钟。注意：RNA在离心之前通常不可见，并在管的侧面和底部形成凝胶状颗粒。5.进行RNA洗涤。RNA洗涤1.从管中取出上清液，只留下RNA颗粒。2.用1mL75％乙醇洗涤沉淀，每1mL初始匀浆中使用的TRIzol®试剂。注意：RNA可以在-20℃下至少1年或在4℃至少1周的75％乙醇中储存。3.短暂旋转样品，然后在4℃下以7500×g离心管5分钟。丢弃洗涤。4.真空或空气干燥RNA颗粒5-10分钟。不要用真空离心机干燥颗粒。注意：不要让RNA完全干燥，因为颗粒会失去溶解性。部分溶解的RNA样品的A260/280比例1.6。5.进行RNA重悬。RNA重悬1.通过移液管尖端将溶液上下移动几次，将RNA沉淀物悬浮于无RNase的水或0.5％SDS溶液（20-50μL）中。注意：如果要将RNA溶解在随后的酶反应中，请勿将其溶解在0.5％SDS中。2.在55-60℃的水浴或热块中孵育10-15分钟。3.继续下游应用，或存储在-70°C。DNA分离步骤从相分离步骤中分离DNA和苯酚-氯仿层。DNA沉淀1.除去覆盖在相间的剩余水相。这对于分离的DNA的质量至关重要。2.每1mL用于初始均化的TRIzol®试剂中加入0.3mL的100％乙醇。3.盖上试管，倒置样品几次混匀。4.在室温下孵育样品2-3分钟。5.在4℃下以2000×g离心管5分钟以沉淀DNA。6.如果需要蛋白质分离，则取出苯酚-乙醇上清液并将其储存在新的管中。清液可以在-70℃下储存几个月。7.使用DNA沉淀物进行DNA洗涤步骤。DNA洗涤1.每1mL用于初始均质化的TRIzol®试剂，用1mL柠檬酸钠/乙醇溶液（0.1M柠檬酸钠，10％乙醇，pH8.5）洗涤DNA沉淀。2.室温孵育30分钟。偶尔混合通过温和倒置。注意：DNA可以在柠檬酸钠/乙醇溶液中保存至少2小时。3.在4℃下以2000×g离心5分钟。取出并弃去上清液。4.重复洗涤（步骤1-3），一次。注意：重复洗涤两次大DNA芯片（200μg）。5.每1mL用于初始均质化的TRIzol®试剂添加1.5-2mL75％乙醇。注意：DNA样品可以在4℃的75％乙醇中储存几个月。6.室温孵育10-20分钟。通过温和倒置偶尔混合管。7.在4℃下以2000×g离心5分钟。取出并弃去上清液。8.空气或真空干燥DNA沉淀5-10分钟。不要让颗粒干燥。不要用真空离心机干燥颗粒。9.进行DNA重悬浮步骤。DNA重悬将DNA重悬于8mMNaOH，浓度为0.2-0.3μg/μL。1.每50-70毫克组织或每1×107个细胞加入0.3-0.6毫升8mMNaOH。注意：由于分离的DNA不能重新悬浮在水或Tris缓冲液中，因此强烈建议重新悬浮DNA是温和的。2.通过在4℃下将样品以12,000×g离心10分钟，去除任何不溶物质。3.将含有DNA的上清液转移到新管中。根据HEPES的需要调整pH值，并进行下游选择。DNA可以在4℃下保存过夜，但长期储存可用HEPES调节至pH7-8，加入1mMEDTA。储存于4°C或-20°C。确定RNA和DNA的产量在260nm和280nm处使用RNA和DNA的吸光度来确定浓度。样品步骤RNA1.在无RNase的水中稀释样品，并测量260nm和280nm处的吸光度。2.使用A260×稀释×40=μgRNA/mL的公式测定浓度。DNA1.将样品稀释至水或缓冲液（pH7.5），并测量260nm和280nm处的吸光度。2.使用A260×稀释×50=μgDNA/mL的公式测定浓度。预期收益率下表列出了各种原料的RNA（A260/2801.8）和DNA（A260/280为1.6-1.8）的典型产率。起始材料数量RNADNA上皮细胞1×106cells8-15μg---新烟叶----73μg---成纤维细胞1×106cells5-7μg5-7μg培养细胞，哺乳动物1×106cells5-7μg骨骼肌肉和大脑胎盘1mg1mg1-1.5μg1-4μg2-3μg2-3μg肝肾1mg6-10μg3-4μg3-4μg3-4μg蛋白质分离步骤在DNA沉淀步骤后剩下的酚-乙醇上清液层中分离出蛋白质。使用蛋白质沉淀或蛋白质透析隔离蛋白质。蛋白沉淀1.每1mL用于初始匀浆的TRIzol®试剂，向酚-乙醇上清液中加入1.5mL异丙醇。2.在室温下孵育样品10分钟。3.在4℃下以12,000×g离心10分钟以沉淀蛋白质。取出并丢弃上清液。4.用剩下的蛋白质沉淀物进行蛋白质洗涤步骤。蛋白质洗涤1.制备由0.3M盐酸胍在95％乙醇中组成的洗涤溶液。2.每1mL用于初始匀浆的TRIzol®试剂，用2mL洗涤溶液洗涤蛋白质颗粒。3.室温孵育20分钟。注意：蛋白质样品可以储存在0.3M盐酸胍-95％乙醇中，在4℃下至少一个月或-20℃下至少一年。4.在4℃下以7500×g离心5分钟。取出并丢弃洗涤溶液。5.重复步骤2-4，再次两次。6.在第三次洗涤和涡旋后，加入2mL100％乙醇至蛋白质沉淀。7.室温孵育20分钟。8.在4℃下以7500×g离心5分钟。取出并丢弃乙醇洗涤。9.将蛋白质颗粒空气干燥5-10分钟。不要让颗粒干燥。10.进行蛋白质再悬浮步骤。蛋白质再悬浮1.向蛋白质沉淀（200μL）中加入1％SDS，上下移液直到蛋白质重悬。注意：要完全溶解蛋白质颗粒，您可能需要在50°C的温度下将样品在水浴或热块中孵育。2.在4℃下以10,000×g离心10分钟以