第六章 化学毒物的一般毒性作用 食品毒理学

第六章化学毒物的一般毒性作用第一节急性毒性作用及其评价第二节蓄积毒性作用及其评价第三节亚慢性和慢性毒性作用及其评第四节联合毒性作用的评价第五节局部毒性作用§第一节急性毒性作用及其评价•一、基本概念•二、急性毒性和急性毒性试验的目的•三、急性毒性试验设计•四、急性毒性评价一、急性毒性试验是指机体一次或在24小时内多次接触外源化学物后在短期内(一般最长14天)所产生的毒效应，包括一般行为和外观改变，大体形态变化以及死亡效应。二、急性毒性试验的目的1.获得受试物对实验动物的致死剂量（LD50）及其它毒性参数(急性毒作用带Zac:acuteeffectzone)Zac=LD50/Limac。2.初步评价毒物对机体的毒效应特征、靶器官、剂量反应关系和对人体产生损害的危险性。3.为亚慢性、慢性毒性试验及其他毒理学试验的剂量设计和观察指标选择提供参考依据。4.为急性中毒的治疗和中毒机制的研究提供线索。三、急性毒性试验设计(一)试验动物–选择原则：•①急性毒性试验要求选择对化学毒物的代谢和毒效应表现与人的反应尽可能一致的试验动物。•②动物易于获得•③品系纯化•④价格较低和易于饲养等条件。三、急性毒性试验设计•1、试验动物的种属和品系–最好用两种种属的动物–啮齿类:小鼠、大鼠、豚鼠或家兔；–非啮齿类：狗或猴。–急性皮肤毒性试验可选用成年大鼠、豚鼠或家兔，优先考虑白色家兔。而急性吸入毒性试验和经口急性毒性试验则优先考虑大鼠。•2、试验动物的年龄和体重：–急性试验动物不宜过老或过幼，通常要求选择刚成年动物进行试验，而且须是未曾交配和受孕的动物。例如：大鼠180～240g、小鼠18～25g、家兔2～2.5kg、豚鼠200～250g、狗10～15kg。同一批试验动物体重变异范围不应超过该批动物平均体重的20％。三、急性毒性试验设计•3.试验动物的性别：–急性毒性试验的主要内容是求LD50，除特殊要求外，一般急性毒性试验对动物性别要求为雌雄各半。如果在预试验时发现化学毒物(如农药)对雌、雄动物毒效应的敏感性有明显差异，则应单独分别求出雌性与雄性动物各自的LD50。如果试验是为致畸试验作准备，也可仅作雌性动物的LD50测试。对精子毒性试验仅选雄性动物。•4.动物数量与随机分组：–一般分为5－7组–大、小鼠等小动物每组10只–狗等大动物每组6只–分组原则——随机化原则•5.禁食：–经消化道染毒时，要求试验前对动物禁食–大鼠、小鼠——隔夜进食；染毒后禁食4h–大动物——每日上午喂食前染毒–染毒后继续禁食2~4h，但在禁食时要保障饮水。•6.实验动物的预检：–选择健康动物–1~2周的检疫期三、急性毒性试验设计（二）试验动物的饲养环境–恒定的温度：22±3℃–湿度：30~70%–照度：昼夜各半–饲料合格、饮水合格、垫料合格（三）染毒途径的选择:染毒途径（exposureroutes）的选择需考虑：模拟人在生活和生产环境中实际接触受试物的途径和方式；有利于不同化学物之间急性毒性大小的比较；受试物的性质和用途；各种受试物毒性评价程序的要求等。最常用的染毒途径为:经口、经呼吸道、经皮及注射途径。•经口(胃肠道)接触:灌胃:小鼠0.21.0ml/只或0.10.5ml/10g；大鼠一次灌胃体积不超过5ml/只家兔不超过10ml/2kg；狗不超过50ml/10kg。吞咽胶囊:•经呼吸道接触:静式吸入；动式吸入•经皮肤接触:•注射途径接触:三、急性毒性试验设计•（四）染毒剂量与分组:•1．预试验（1)预试验的目的•得到受试物对实验动物以某种接触途径的10％－90％致死剂量范围。（2)查阅文献•①了解化学毒物的结构式、分子量、常温常压下的状态、熔点、沸点、密度、闪点、挥发度、蒸气压、水溶性和脂溶性等理化特性，生产批号及纯度，杂质成分与含量等。•②确定使用哪一种计算方法求LD50，然后再设计剂量分组。LD50的计算方法常用寇氏法、概率单位法、霍思法等。•③找出与受试化学毒物结构与理化性质近似的化学物的毒性资料，并以文献资料中相同的动物种系和相同接触途径所测得的LD50(LC50)值作为受试化学物的预期毒性中值。三、急性毒性试验设计•（四）染毒剂量与分组:–(2)预试验的剂量设计–①等比剂量设计（已知LD50剂量，并在该剂量的上下各设计l一2个剂量组作为预试验剂量。）–②3x3法：取9只动物，分为3组，每组3只，以三种不同剂量处理，组距拉大一些。（对于无资料可参考的受试物，为节省动物。）–③序贯法:将动物一只一只序贯进行。（对于无资料可参考的受试物，为节省动物。）三、急性毒性试验设计•（四）染毒剂量与分组:•2．正式试验;•（1）根据预试验的死亡资料确定正式实验组距和公比：可根据以下公式计算出剂量分组：i=(lgLD90-lgLD10)／(n-1)或i=(lgLD100-lgLD0)／(n-1)；式中i为组距(相邻的两个剂量组对数剂量之差)；n为设计的剂量组数。正式实验组的公比：r=lg－1（lgb-lga)/n-1或公式中，b为最高剂量，a为最低剂量，n为试验动物组。•（2）正式试验剂量分组公比r和组距i确定后，进行正式试验分组。第一组剂量为a，第二组为ar，第三组为ar2…n组为arn-1。•3.试验设计和LD50计算：试验设计和LD50计算的方法有多种，重点介绍最常用的四种方法。即改良寇氏法、霍恩氏法、威尔氏法和概率单位法。三、急性毒性试验设计•（五）试验周期一般为2为宜•（六）毒效应观察–1.中毒症状•2.体重•在观察试验动物中毒症状的过程中，应同时观察体重的变化。体重可以反映动物中毒后的整体变化。体重改变的原因很多，若化学毒物刺激或损伤消化道可出现试验动物饮食减少甚至拒食，表现为体重减轻。若化学毒物引起腹泻，将影响食物吸收和利用，体重也会减轻。如果化学毒物影响水的摄取或肾功能急性损伤，也可能在体重上反映出来。所以，对存活动物尤其是对低于LD50剂量组的存活动物，应在观察期14天内称量其体重的变化，以便了解受试物引起毒效应的持续时间。•3.病理检查及其他指标:•急性毒性试验中，对死亡的动物均应及时进行大体解剖和病理组织学检查，肉眼观察主要脏器的大体病理变化，如脏器大小、外观、色泽的变化，有无充血、出血、水肿或其它改变，对有改变的脏器进行取材做组织病理学检查。对存活动物在观察期结束时进行大体病理检查。必要时做组织病理学检查。根据试验需要可进一步扩大观察项目．如体温、心电图、脑电图或进行某些生化指标测定等。•4.死亡和死亡时间•重点观察和记录每只动物死亡的时间，特别是最早出现死亡的时间以及各个剂量组动物的死亡数。分析中毒死亡时间的规律具有一定意义，可为深入研究化学物的毒作用机制提供参考。三、急性毒性试验设计•(七)经典急性毒性试验的局限性–1.消耗的动物量大–2.获得的信息有限–3.测得的LD50仅仅是一个近似值–4.在安全性评价中仅评价动物死亡和简单的症状观察是不够的，更需要的是生理学、血液学及其它化验检查所提供的深入细致的毒性信息。四、急性毒性评价外源化学物急性毒性分级（WHO）毒性分级大鼠一次经口LD50(mg/kg)6只大鼠吸入4小时，死亡2~4只的浓度(ppm)兔经皮LD50(/mg/kg)对人可能致死的估计量g/kg总量(g/60kg)剧毒11050.050.1高毒1~10~5~0.05~3中等毒50~100~44~0.5~30低毒500~1000~350~5~250实际无毒5000~10000~2180~151000四、急性毒性评价我国食品毒理急性毒性分级法(1994)急性毒性分级大鼠经口LD50(mg/kg)大致相当于70kg人的致死量6级(极毒)1稍尝,7滴5级(剧毒)1~507滴~1茶匙4级(中等毒)51~5001茶匙~35克3级(低毒)501~500035~350克2级(实际无毒)5001~15000350~1050克1级(无毒)150001050克•一、基本概念•二、蓄积毒性试验方法及其评价第二节蓄积毒性作用及其评价化学毒物进入机体后，经过生物转化以代谢产物或化学物原型排出体外。但是，当化学毒物反复多次给动物染毒，化学毒物进入机体的速度(或总量)超过代谢转化的速度和排泄的速度(或总量)时，化学毒物或其代谢产物就有可能在机体内逐渐增加并贮留，这种现象称为化学毒物的蓄积作用(accumulation)。蓄积作用实际上有二个含义：物质蓄积(materialaccumulation):化学分析的方法能够测出机体内存在该物质或其代谢产物时。功能蓄积(functionalaccumulation):多次接触一定时间后，虽不能测出该物质或其代谢产物，但机体有慢性中毒的症状出一、基本概念二、蓄积毒性试验方法及其评价–化学毒物的蓄积作用是发生慢性中毒的物质基础，因此研究化学毒物在机体内的蓄积性是评价化学毒物能否引起潜在慢性毒性的依据之一，也是食品标准制订过程选择安全系数的主要依据。–蓄积毒性试验是研究化学毒物基础毒性的重要内容之一，目的是通过试验求出蓄积系数K，了解化学毒物蓄积毒性的强弱，并为慢性毒性试验及其他有关毒性试验的剂量选择提供参考。•(一)蓄积系数法–蓄积系数(accumulationcoefficient)是多次染毒使半数动物出现效应(或死亡)的累积剂量[ED50(n)]与一次染毒使半数动物出现相同效应(或死亡)的剂量[ED50(1)]的比值，即：K＝ED50(n)/ED50(1)K＝LD50(n)/LD50(1)表6-5蓄积系数的分级标准K＜1高度蓄积1≤K＜3明显蓄积3≤K＜5中等蓄积5≤K轻度蓄积二、蓄积毒性试验方法及其评价1．固定剂量法：一般常选用大、小鼠灌胃或腹腔注射方法进行染毒。先求出LD50，然后选取相同条件的40只(或更多)实验动物，分为两组，一为染毒组，一为对照组，每组至少20只，雌雄各半。试验组在1/20～l/50LD50的范围内选定一个剂量，每日以固定剂量、定时和相同途径进行染毒,试验期间观察记录每组动物死亡数。当试验组累积发生一半动物死亡即可终止试验。此时，计算累积总接触剂量[LD50(n)]，根据公式计算K值，然后依表6-5进行评价。但若接触剂量已累积达到5个LD50剂量，也可终止试验。二、蓄积毒性试验方法及其评价2．剂量递增法：在试验期间，当化学毒物引起动物累积死亡一半时即可终止试验，计算K值进行评价。一般来说，在试验第2l天也可结束试验，因为这之前如果动物没有死亡或死亡数不足一半，说明其累积剂量已达5.26LD50，即K＞5。使用本方法时要注意染毒期间定期(每4天一次)给动物称重，按实测体重，调整化学毒物的染毒绝对量。二、蓄积毒性试验方法及其评价•3．剂量固定的20天蓄积法：它通常采用经口灌胃染毒方式，将动物随机分为5个组，包括阴性对照组和1/20LD50、l/10LD50、1/5LD50和1/2LD50四个剂量组，每组动物数10只，雌雄各半。每日染毒一次，连续染毒20天。观察每组雌雄合计的死亡动物数量。试验结束时根据下列标准进行评定：①各剂量组均无死亡，即为蓄积性不明显；②如仅1/2LD50剂量组有死亡，其他组均无死亡，则为弱蓄积性；③如1/20LD50剂量组无死亡，其他各组间死亡数有剂量反应关系时，则为中等蓄积性；④如1/20LD50剂量组有死亡，且有剂量反应关系，则为强蓄积性。二、蓄积毒性试验方法及其评价（二)生物半减期法：生物半减期(biologicalhalf-life，t1/2)法是用毒物动力学原理描述化学毒物在机体内的蓄积作用。一般来说，t1/2d较短的化学毒物达到蓄积极限所需的时间也短，t1/2长者达到蓄积极限的时间也长。二、蓄积毒性试验方法及其评价一亚慢性毒性作用：亚慢性毒性的概念亚慢性毒性试验的目的亚慢性毒性试验的设计二慢性毒性作用：慢性毒性的概念慢性毒性试验的目的慢性毒性试验设计第三节亚慢性和慢性毒性作用及其评价(一)概念：亚慢性毒性(subchronictoxicity)是指人或实验动物连续接触较长时间、较大剂量的外源化合物所引起的毒性效应。慢性毒性(ch