基因克隆的基本理论及实验技术

课时及内容安排第一课时:基因克隆的基本概念及理论知识第二课时:基因克隆的操作过程及注意事项第三课时:实验操作过程演示(录像)第一课基因克隆的基本概念及理论知识基因克隆的定义：1.工具书上：插入有同一个基因或DNA片段的重组质粒的一个群体，这个群体是由一个重组质粒增殖而来，通过基因克隆技术可获得某个基因或DNA片段的克隆。2.学术文献上：(1)基因克隆是指在体外对DNA按照即定目的和方案进行人工重组,将重组DNA进行扩增以获得目的基因的大量拷贝。(2)它是将DNA或基因组的DNA片段嵌入克隆载体，再将载体植入培养的宿主细胞。(3)科学家将这一过程称为基因克隆：基因表达需有调节的DNA片断控制，要使克隆到的基因能表达、发挥作用，必须将其与调节单位连接起来。什么是基因？1、基因是存在于细胞内有自体繁殖能力的遗传单位。2、基因是一个具有遗传功能的特定核苷酸序列的DNA片段。3、编码一个RNA或一条多肽链的DNA片段称为一个基因。4、基因是生物体遗传的基本单位，存在于细胞的染色体上，作直线排列。5、基因通过指导蛋白质的合成来传递遗传信息，从而控制生物的性状。染色体、DNA与基因之间的关系基因的结构及其表达蛋白的过程翻译蛋白质转录初级转录本（hnRNA）加工成熟mRNA加帽加poly（A）基因（DNA）转录起始调控区转录终止信号转录起始点外显子内含子转录终止点5’非翻译区3’非翻译区RT-PCR双链cDNART-PCR扩增基因的编码区序列mRNA5’AAAAAAAAAAAAAAAAA3’3’TTTTTTTTTTTT5’RT反应TTTTTTTTTTTT5’单链cDNA3’PCR扩增3’3’5’5’转录起始调控区（启动子区）的扩增基因（DNA）转录起始调控区转录终止信号转录起始点外显子内含子转录终止点PCR扩增3’3’5’5’启动子区序列基因的编码区及启动子区序列必须通过连接到质粒上构建成重组表达载体，然后进行目的片段扩增及功能研究。什么是质粒（Plasmid）？质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。许多细菌除了染色体外，还有大量很小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)。质粒的重要特征（1）是染色质外的环形双链DNA分子；（2）能自主复制，是能独立复制的复制子；（3）质粒对宿主生存并不是必需的；（4）质粒上常带有耐抗生素基因；（5）质粒DNA上有多个酶切位点。限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）:是从细菌中分离出来的一种识别并切割特异的双链DNA序列的内切核酸酶。目前已从多种细菌中分离出超过400种，识别各自不同的核苷酸顺序。GAATTCCTTGGAAAGCTTTTCGAAEcoRIGCTTGGAATTCAHindIIIATTCGAAGCTTA限制性核酸内切酶的命名法则限制性核酸内切酶的命名：一般是以微生物属名的第一个字母和种名的前两个字母组成，第四个字母表示菌株(品系)。例如：EcoRI是从大肠杆菌EscherichiacoliRY13中第一个发现的内切酶I。EEscherichia(属)cocoli(种)RRY13(品系)I首先发现在此类细菌中发现的顺序DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的，最初是在大肠杆菌细胞中发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5’-PO4与另一DNA链的3’-OH生成磷酸二酯键将两条紧邻DNA链连接起来。DNA连接酶GAATTCCTTGGA连接酶GCTTGGAATTCA连接酶CTGGACATTTAACTGATTGACTAAOHPO4内切酶和连接酶是基因克隆实验中两种重要的工具酶，它们如同分子生物学家剪刀和针线，可以任意地将感兴趣的基因片段进行切割和连接，实现DNA序列的重组。质粒(plasmid)和载体(vector)有什么区别？质粒是指细菌细胞质中的小型环状DNA分子，是天然存在的，主要控制细菌的次级代谢。载体是指在基因工程中用以协载目的基因的小型环状DNA分子，载体一般是经过改造的质粒，还包括病毒，部分高等生物细胞中的DNA。载体的种类克隆载体：一般是只用来在大肠杆菌中扩增基因序列的拷贝数。表达载体：除了能扩增基因序列的拷贝数之外，还能在原核或真核细胞中表达目的蛋白，也可用鉴定基因表达调控元件的功能。根据表达目的蛋白所使用启动子不同分为原核表达载体（原核启动子）和真核表达载体（真核启动子）。非定向克隆+或TA克隆载体TTAA酶切位点定向克隆的克隆载体pUC192686bpAPrALPHAP(BLA)P(LAC)ORIAvaI(413)BamHI(418)EcoRI(397)HindIII(448)PstI(440)SmaI(415)XmaI(413)ApaLI(178)ApaLI(1121)ApaLI(2367)非定向克隆+克隆的片段只能按特定方向连接pUC192686bpAPrALPHAP(BLA)P(LAC)ORIAvaI(413)BamHI(418)EcoRI(397)HindIII(448)PstI(440)SmaI(415)XmaI(413)ApaLI(178)ApaLI(1121)ApaLI(2367)EcoRI+HindIII切EcoRIHindIIIEcoRIHindIIIEcoRIHindIIIEcoRIHindIIIAAEcoRI+HindIII切PCR扩增EcoRIHindIII表达载体根据表达目的蛋白所使用启动子不同分为：原核表达载体（原核启动子）真核表达载体（真核启动子）原核表达载体pGEX-4T14969bpGSTlacIqtacpromoterThrombinsiteMCSAMP+BamHI(931)EcoRI(940)NotI(961)SmaI(947)XhoI(955)真核表达载体pCMV-EGFP4749bpEGFPNeo/Kan-RPCMVSV40polyA目的蛋白表达载体中的表达盒启动子（Promoter）基因编码蛋白序列（CDS）转录终止信号区（CDS）基因克隆是将DNA或基因组的DNA片段嵌入克隆载体，再将载体植入培养的宿主细胞，进行载体扩增或表达蛋白。大肠杆菌大肠杆菌（Escherichiacoli，E.coli）革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×1～3微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。正常栖居条件下不致病。大肠杆菌在生物技术中的应用大肠杆菌作为外源基因表达的宿主,遗传背景清楚,技术操作简单,培养条件简单,大规模发酵经济,倍受遗传工程专家的重视.目前大肠杆菌是应用最广泛,最成功的表达体系,常做高效表达的首选体系。生物安全性生物工程用的菌株是在不断筛选后被挑选出的菌株。这些菌株由于失去的细胞壁的重要组分，所以在自然条件下已无法生长。甚至普通的清洁剂都可以轻易地杀灭这类菌株。这样，即便由于操作不慎导致活菌从实验室流出，也不易导致生化危机。此外，生物工程用的菌株基因组都被优化过，使之带有不同基因型（例如β半乳糖甘酶缺陷型），可以更好的用于分子克隆实验。基因克隆的实验常用菌株1：DH5a常用于质粒克隆的菌株。使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。2：TOP10该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。3：HB101该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验。4：JM109该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株。5：BL21(DE3)用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合表达非毒性蛋白。质粒转化大肠杆菌的过程基因克隆实验的一般过程获得基因序列：通过RT-PCR或基因组数据库获得引物设计及PCR扩增目的片段PCR产物连接到载体上构建成重组载体重组载体转化到大肠杆菌中进行质粒扩增或表达蛋白第二课基因克隆的操作过程及注意事项基因克隆实验室安全事项1.仪器设备的使用及维护2.实验试剂及安全性仪器设备的使用及维护1.移液器(加样枪)2.5µl10µl200µl1000µl(1)根据液体体积使用尽可能小规格的枪；(2)吸取液体时应缓慢，以防液体冲上来污染枪。(3)不要用吸收强酸液体（如浓盐酸和浓硫酸）以防止腐蚀枪。应用有刻度的玻璃吸管替代。(4)如较长时间不使用枪时应将吸取刻度调至最大处，竖直置于架子上。2.离心机(1)样品要保持平衡；(2)如低温（4度）离心机应先降温后离心样品；(3)使用间隙应经常盖上，防止冷气丧失。(4)使用最大离心速度应略低于厂家规定的最大速度。3.超净工作台(1)使用前开紫外灯照15至30分钟，进行杀菌处理；然后关上紫外灯打开照明灯和吹风机吹5分钟才能使用，以排除臭氧。(2)使用切记关上紫外灯，以烧伤皮肤；(3)使用完应打紫外灯照15至30分钟，一般情况下不需要开紫外过夜。4.恒温摇床及培养瓶(1)先开电源开关，将速度调至最低处然后缓缓加速至所需速度，以防止培养瓶震出来，或瓶中培养液溢出。(2)瓶中培养液不能超过培养瓶最大体积的1/3，以防止液体溢出和保证菌培养所需的气体空间。5.恒温培养箱工作时切记关上门，以保证温度恒定和减少加热器的工作时间。6.水浴槽8.电泳系统分子克隆常用的有毒试剂1.溴化乙锭:（Ethidiumbromide，EB）用来染DNA和RNA的染料,是一种致癌物质；它是DNA突变的诱变剂，可以嵌入DNA，使DNA发生突变，致癌。有累积效应，不要直接接触，但是要注意通过呼吸摄入，故此环境要通风。EB可以被皮肤吸收。做实验的时候一定要带手套。但是，只要按照标准的操作使不会有问题的。严禁随便丢弃。因为EB是强致癌性，而且易挥发，挥发至空气中，危害很大。2.DEPC：DEPC即二乙基焦碳酸酯（diethylprocarbonate），可灭活各种蛋白质，是RNA酶的强抑制剂；DEPC是一种潜在的致癌物质，在操作中应尽量在通风的条件下进行，并避免接触皮肤。DEPC毒性并不是很强，但吸入的毒性是最强的，使用时戴口罩。不小心占到手上注意立即冲洗。3.苯酚：苯酚又名酚或石碳酸,为高毒类原浆毒物,对人体危害严重。它的浓溶液对皮肤有强烈的腐蚀性,苯酚所致的急性中毒常常造成死亡。4.氯仿：三氯甲烷，侵入途径：吸入、食入、经皮吸收。健康危害：主要作用于中枢神经系统，具有麻醉作用，对心、肝、肾有损害。吸入或经皮肤吸收引起急性中毒，初期有头痛、头晕、恶心、呕吐、兴奋、皮肤粘膜有刺激症状，以后呈现精神紊乱、呼吸表浅、反向消失、昏迷等，重者发生呼吸麻痹、心室纤维性颤动、并可有肝、肾损害。误服中毒时，胃有烧灼感、伴恶心、呕吐、腹痛、腹泻以后出现麻醉症状。慢性中毒：主要引起肝脏损害，此外还有消化不良、乏力、头痛、失眠等症状，少数有肾损害。5.十二烷基硫酸钠（SDS）：提取质粒使用的溶液II中含有SDS，对粘膜和上呼吸道有刺激作用，对眼和皮肤有刺激作用。可引起呼吸系统过敏性反应。。6.其它常用的试剂如强酸强碱都有很强的腐蚀性。基因克隆相关实验1.相关软件的使用(查询序列,引物设计及质粒图谱绘制)2.总RNA提取及RT-PCR实验3.琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物及PCR产物回收4.质粒DNA酶切反应5.DNA连接反应6.大肠杆菌感受细胞的制备及重组质粒转化7.质粒提取