形成一个细菌菌落

绪论生物技术也叫生物工程细胞工程发酵工程蛋白质工程酶工程基因工程１、细胞工程植物细胞工程动物细胞工程植物组织培养植物体细胞杂交细胞培养细胞融合胚胎移植核移植单克隆抗体的产生２、发酵工程发酵工程是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程的一种新技术。发酵工程的内容包括菌种的选育、培养基的配制、灭菌、扩大培养和接种、发酵过程和产品的分离提纯等方面。３、蛋白质工程改变个别氨基酸改变蛋白质的性质４、酶工程通过基因工程的手段改变酶或蛋白质的折叠方式、空间结构、催化火星和稳定性微生物包括哪五类：病毒细菌放线菌真菌原生动物特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.原核生物界原生生物界真菌界病毒界微生物基础知识细菌细胞由外向里依次有鞭毛、菌毛、荚膜、细胞壁、细胞膜、细胞质，细胞质中又有液泡、储存性颗粒、核质等。细菌的构造图1-3细菌的结构有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。例如，有的细菌的芽孢，煮沸3小时以后才死亡。芽孢又小又轻，可以随风飘散。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌.菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。资料:大肠杆菌（Escherichiacoli，E.coli）革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×1～3微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。正常栖居条件下不致病。但若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。在肠道中大量繁殖，几占粪便干重的1/3。兼性厌氧菌。实验一:大肠杆菌的培养和分离一、实验目的:1.进行大肠杆菌的扩增,利用液体培养基进行细菌培养的操作。2.进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基进行细菌的划线培养。3.说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理二、实验原理:大肠杆菌的新陈代谢是异养兼性厌氧型，在生态系统的身份（消费者、分解者），因此可以用LB液体培养基（通用的细菌培养基或普通的细菌培养基）扩大培养。培养后再在LB固体平面培养基上划线进行分离，分离后，培养基上会形成一个个单独的菌落，便于观察鉴定。这种方法有利于消除污染杂菌，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。实验步骤：配置培养基培养基灭菌倒平板接种划线分离培养观察无菌技术固体培养基（加琼脂）用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定等液体培养基（不加琼脂）：增菌培养、鉴别性培养表面生长均匀混浊生长沉淀生长3、半固体培养基观察微生物的动力，有时用来保藏菌种。４、选择培养基加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基:分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物在培养基中加入某种物质以杀死或抑制不需要的菌种生长的培养基，称之为选择培养基。５、鉴别培养基伊红美蓝琼脂培养基是一种鉴别培养基。常用于检查乳制品和饮用水中是否含有致病性的肠道细菌。培养基中的伊红为酸性染料，美蓝则为碱性染料。当大肠杆菌发酵乳糖产生混合酸时，细菌带正电荷，与伊红染色，再与美蓝结合生成紫黑色化合物。在此培养基上生长的大肠杆菌形成呈紫黑色带金属光泽的小菌落。而产气杆菌则形成呈棕色的大菌落。不能发酵乳糖的细菌产碱性物较多，带负电荷，与美蓝结合，被染成蓝色菌落。三、实验操作要求：1.培养基的配比与制作原理:培养基是微生物的生存环境和营养物质,必须无菌。俗话说，“细菌喜荤，霉菌喜素”细菌培养基通常要用蛋白胨和酵母提取物配制,加入一定的氯化钠（维持一定的渗透压）。霉菌培养一般用无机盐配置或添加蔗糖的豆芽汁．细菌通常要求在中性偏碱的环境中生长霉菌要求在中偏酸的环境中生长所以在配制培养基时需调节培养基的酸碱度。（一）培养基的营养组成不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、无机盐、等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质．例如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。1．计算、称量2．溶化3．调pH：pH7．64．过滤：这一步可以省去。5．分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上或壁上，否者容易发生污染。分装三角烧瓶和试管中必须用三角漏斗，分装的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。固体培养基约为试管高度的l/5,灭菌后制成斜面.一、培养基配置步骤6.加棉塞试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞.棉塞塞入试管或三角瓶口后周围没有皱褶和缝隙，容易拔出，手提棉塞不能落下.最好用封口膜取代棉塞7．灭菌:高压蒸汽灭菌培养基灭菌：①普通培养基灭菌：将50ml培养基用三角漏斗移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121℃，灭菌15～30min。②含葡萄糖的培养基：500g/cm290℃，灭菌30分钟。防止其发生碳化。③如含尿素的培养基：用灭过菌的G6玻璃砂漏斗过滤各种器皿的灭菌：高压蒸汽灭菌各种器皿灭菌前均需要用牛皮纸或报纸包好。如果是试管或三角瓶？消毒和灭菌的区别条件结果常用方法灭菌消毒杀死所有体内外所有的微生物包括芽孢和孢子仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物强烈的理化因素温和的物理或化学方法灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭紫外线或化学试剂消毒法、煮沸消毒法8．倒平板:待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯附近倒平板。（倒平板操作见课本）2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种.注意：１、平板冷凝后将平板倒置？防止？２、倒平板过程中，不能将培养基贱在皿盖和皿底之间的部位，防止空气中的微生物在这些位置滋生３、无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。无菌技术？倒平板技术1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。9、分离和纯化大肠杆菌平板划线分离和涂布分离法平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养基的表面.在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.微生物的接种技术平板划线的操作一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。接种操作示意图灼烧接种后要冷却后才能伸入菌液、以免温度太高杀死菌种。划线最后一区域不能与第一区域相连。划线力度要合适，防止用力过大刺破培养基。1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。二.无菌技术(灭菌操作):在培养微生物时必须进行无菌操作。（1）各种器皿必须是无菌的，如各种大小的培养皿、试管等等通常用高压蒸汽灭菌法灭菌（自主学习：P20-21）。（2）各种培养基也必须是无菌的。如加入培养基的三角瓶、试管也要在1210C下灭菌15min（自主学习：P21）。（3）在操作过程中必须是无菌的（菌转移操作必须是无菌的）。在将培养基加入到三角瓶、试管和培养皿中时，三角瓶口、试管口、和培养皿壁上不能沾有培养基，否则容易发生污染（自主学习：P21）涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。本课题知识小结:利用微生物分解玉米淀粉生产糖浆，具有广阔的应用前景。但现有野生菌株对淀粉的转化效率低，某同学尝试对其进行改造，以获得高效菌株。（1）实验步骤：①配置________（固体、半固体、液体）培养基，该培养基的碳源应为________。②将_____________接入已灭菌的培养基平板上。③立即用适当剂量的紫外线照射，其目的___________________。④菌落形成后，加入碘液，观察菌落周围培养基的颜色变化和变化范围的大小。周围出现_______________现象的菌落即为初选菌落，经分离、纯化后即可达到实验目的。答案：（1）①固体、玉米淀粉；②野生菌株；③（诱发野生菌株发生基因突变）对野生菌株进行诱变；④（透明圈）浅色范围大；（2）编码区、非编码区某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验。实验包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察计数。请回答与此实验相关的问题。（1）培养基中含有的蛋白胨、淀粉分别为细菌培养提供了____和______。除此之外，培养基还必须含有的基本成分是_____和______。（2）对培养基进行灭菌，应该采用的方法是_______。（3）为了尽快观察到细菌培养的实验结果，应将接种了湖水样品的平板置于______中培养，培养的温度设定在37℃。要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种______作为对照进行实验。（4）培养20小时后，观察到平板上有形态和颜色不同的菌落，这说明湖水样品中有_____种细菌。一般说来，菌落总数越多，湖水遭受细菌污染的程度越_______。（5）如果提高培养基中NaCl的浓度，可以用于筛选耐_______细菌，这种培养基被称为____。1）氮源（碳源不作要求）碳源、无机盐、水（2）高压蒸汽灭菌3）恒温培养箱无菌水（4）多；高（5）盐（或NaCl），选择性培养基【典例解析】例1．关微生物营养物质的叙述中，正确的是A.是碳源的物质不可能同时是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的无机物只提供无机盐D.无机氮源也能提供能量解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHCO3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。答案：D例2．下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是A.防止杂菌污染B.消灭杂菌C.培养基和发酵设备都必须灭菌D.灭菌必须在接种前答案：B解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是正确的，因为与发酵有