6第六章：高效毛细管电泳

1第一节：概述第六章：高效毛细管电泳（HPCE）在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。一、高效毛细管电泳的发展1909年，L.Michaelis提出“电泳”这一术语，他的实验是用于测定蛋白质的等电点。此后，许多的研究报告涉及氨基酸、肽类、蛋白质的分离。为了防止电泳完成了的溶液中，再次发生对流混合，曾使用了各种稳定介质，如琼脂、纤维粉、玻璃丝、硅胶及丙烯酸胺；为了防止热扩散而使用了一种内径小的管道，管道内径由3mm缩小至75μm。21937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白；发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定；第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；1948年，获诺贝尔化学奖；1981年，Jorgenson．和Lukacs使用75μm内径的熔融石英毛细管，电泳分离氨基酸和肽，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术——高效毛细管电泳。34二、高效毛细管电泳的特点1.仪器简单、易自动化，灵敏度高电源、毛细管、检测器、溶液瓶紫外检测器的检测限可达10-13～10-15mol，激光诱导检测器可达10-19～10-21mol；52.分析速度快、分离效率高在3.1min内分离36种无机及有机阴离子，4.1min内分离了24种阳离子；分离柱效：105～107/m理论塔板数；3.操作模式多，分析方法开发容易只要更换毛细管内填充溶液的种类、浓度、酸度和添加剂等，就可以用一台仪器实现多种分离模式。4.操作方便、消耗少毛细管长仅50~70cm，内径20~75μm，容积仅几微升，进样量极少，水介质中进行；5.应用范围极广有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等；6三、高效毛细管电泳的几种模式1、毛细管区带电泳（CZE）带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；阴离子：两种效应的运动方向相反；ν电渗流ν电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,同种类离子由于差速迁移被相互分离。最基本、应用广的分离模式；71）缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。2、胶束电动毛细管色谱（MECC，MEKC）在电场力的作用下，胶束在柱中移动。2）电泳流和电渗流的方向相反，且ν电渗流ν电泳，负电胶束以较慢的速度向负极移动；5）色谱与电泳分离模式的结合。3）中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；4）可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围；83、毛细管凝胶电泳（CGE）将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，CZE模式很难分离，采用CGE能获得良好分离，DAN排序的重要手段。特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。91.根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；2.毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（6～8V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度；3.氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pH有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；4.聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点pH的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离；5.阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOH溶液；6.加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测；7.电渗流在CIEF中不利，应消除或减小。4、毛细管等电聚焦（CIEF）101.将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子(充满毛细管)和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，并以同一速度移动。2.负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。5、毛细管等速电泳（CITP）3.不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同(ν=μE)，淌度大的离子区带电场强度小；沿出口到进口，将不同区带依次排序1、2、3、4电场强度依次增大。假设“2”号中离子扩散到“3”号，该区电场强度大，离子被加速，返回到“2”区；当“2”号中离子跑到“1”号区，离子被减速使之归队；4.特点：界面明显，富集、浓缩作用；11在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以电渗流为流动相，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程；6、毛细管电渗色谱（CEC）12第二节：高效毛细管电泳理论一、基本原理所受的电场力为：FE=qE所受的阻力（即摩擦力）为：F=fν平衡时电场力和摩擦力相等而方向相反：qE=fνq—离子所带的有效电荷；E—电场强度；ν—离子在电场中的迁移速度；f—平动摩擦系数(对于球形离子：f=6πηγ；γ—离子的表观液态动力学半径；棒状离子：f=4πηγ；η—介质的粘度；)所以，迁移速度：EqfqEπ6（球形离子）物质离子在电场中差速迁移是电泳分离的基础。电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移速度。当带电离子以速度ν在电场中移动时，13二、毛细管电泳中电渗现象与电渗流1.电渗现象当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层，二者之间存在电位差。当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象。电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（简称EOF）。142.毛细管电泳中的电渗现象与电渗流石英毛细管柱，内充液pH3时，表面电离成-SiO-,管内壁带负电荷，形成双电层。在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，速度ν电渗流。15（1）电渗流的大小与方向电渗流的大小用电渗流速度νeo表示，取决于电渗淌度μeo和电场强度E。即νeo=μeoE电渗淌度取决于电泳介质及双电层的Zeta电势，即μeo=ε0εξ/ηε0—真空介电常数；ε—介电常数；ξ—毛细管壁的Zeta电势。νeo=ε0εξE/η实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算νeo=Lef/teoLef—毛细管有效长度；teo—电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。16电渗流的方向电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；内表面带正负电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极；石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；改变电渗流方向的方法：1）毛细管改性表面键合阳离子基团；2）加电渗流反转剂内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。17（2）电渗流的流形电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（谱带展宽很小）；液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽较大）。18（3）电渗流的作用电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5～7倍；各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：ν+=νeo+ν+ef阳离子运动方向与电渗流一致；ν-=νeo-ν-ef阴离子运动方向与电渗流相反；ν0=νeo中性粒子运动方向与电渗流一致；193.影响电渗流的因素（1）电场强度的影响电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。（2）毛细管材料的影响不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；20（3）电解质溶液性质的影响1）溶液pH的影响对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7，达到最大；pH3，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持pH稳定。2）阴离子的影响在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电渗流下降。2122（4）温度的影响毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。温度变化来自于“焦耳热”；焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；HPCE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。温度每变化1，将引起背景电解质溶液黏度变化2%～3%；23（5）添加剂的影响1）加入浓度较大的中性盐，如K2SO4，溶液离子强度增大，使溶液的黏度增大，电渗流减小。2）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向；加入不同阳离子表面活性剂来控制电渗流。加入阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），可以使壁表面负电荷增加，zeta电势增大，电渗流增大；3）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使电渗流增大。244.HPCE中电渗流的控制25三、淌度淌度：带电离子在单位电场下的迁移速度；淌度不同是电泳分离的基础。1.绝对淌度μab无限稀释溶液中带电离子在单位电场强度下的平均迁移速度，简称淌度。可在手册中查阅。2.有效淌度μef实际溶液中的淌度(实验中测定的)。μef=∑aiμiai—溶质i的解离度；μi—溶质i在解离状态下的绝对淌度3.表观淌度μap离子在实际分离过程中的迁移速度（表观迁移速度）：νap=μapEμap大小等于离子的有效淌度和电泳淌度的矢量和：π6qE26四、毛细管电泳的分析参数1.迁移时间（保留时间）：VLLELLtapefapefapef27282.毛细管电泳柱效率在HPCE中，仅存在纵向扩散，σ2=2Dt22/154.5N;22NYtDELDLVLRefapefap扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生物大分子（蛋白质、核酸等）的依据。293.分离度DLVLRefaps177.0分离度可按谱图直接由下式计算：1212)(2WWttRs4LWLRS4LRLLefSef所以由于4NN2SefRL所以由于30第三节：毛细管电泳中影响柱效率的因素1.纵向扩散引起的峰加宽在HPCE中，纵向扩散引起的峰展宽：σ2=2Dt由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小，可获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。2.进样引起的峰加宽当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。分离效率明显下降；理想情况下，进样塞长度：Winj=(24Dt)1/2实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的1%～2%。一般为10～50nL,甚至小到100pL。313.焦耳热与温度梯度引起的峰加宽电泳过程产生的焦耳热可由下式计算：2b2EcLrπIVQ散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），破坏了塞流，导致区带展宽。λ—背景电解质溶液的摩尔电导；I—工作电流：cb—背景电解质浓度；改善方法：（1）减小毛细管内径；（2）控制散热；324.溶质与管壁间的相互作用引起的峰加宽存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽；蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，吸附问题特别严重，是目前分离分析该类物质的一大难题。细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比表面积大，又增加了溶质吸附的机会。减小