液相色谱串联质谱在临床检验中的应用-核医学专业网

2017-9-91液相色谱串联质谱在临床检验中的应用吴超超2017.09.09报告提纲1.背景介绍2.儿茶酚胺及其代谢物检测3.肺部结节早期诊断2017-9-92质谱检测质谱（又叫质谱法，MassSpectrometry）是一种通过制备、分离、检测气相离子来鉴定化合物的专门技术，广泛地应用于各个领域中。在众多的分析测试方法中，质谱学方法被认为是一种同时具备高特异性和高灵敏度的且被广泛应用的普适性方法，在临床研究的应用方面，质谱已成为国际公认的定量分析首选技术。质谱组成+++进样系统离子源质量分析器检测器数据系统真空系统质谱主要用于鉴定，定量：代谢小分子，蛋白质，核苷酸，药物小分子，肽段，合成有机物，聚合物等精确测量带电离子质荷比(质量电荷比)的分析仪器2017-9-93•样品用量少•检测限高1-2个数量级灵敏度高•检测错误率低，如Tg蛋白检测（30%）特异性好•内标参入方法稳定可靠，可重复性强稳定性高•单次实验同时测定多个目标化合物多指标分析基因测序TranscriptionTranslationDynamicinteraction遗传信息DNA质谱定量表型信息RNA蛋白质代谢小分子精准检测精准医疗与质谱优势儿茶酚胺及其代谢物检测——神经内分泌肿瘤-嗜铬细胞瘤的诊断2017-9-94Ø嗜铬细胞是构成肾上腺髓质的分泌细胞，胞浆内含有嗜铬颗粒，发生嗜铬反应Ø嗜铬细胞瘤为起源于神经外胚层嗜铬组织，是一种分泌儿茶酚胺的肿瘤嗜铬细胞瘤u位于肾上腺者约占80-85%（PCC，嗜铬细胞瘤）l大多数为一侧性，约占80%以上；l少数为双侧性，约占10%；l单侧肾上腺瘤和肾上腺外瘤约为10%u肾上腺外嗜铬细胞瘤（约占15-20%）(PGL，副神经节瘤)l主要位于腹部，多在腹主动脉旁；l其他部位少见：l更少见：胸内（主要在后纵隔或脊柱旁）、颈部、颅内•肾门、肾上极、肝门区、肝以及下腔静脉之间；•近胰头部位，卵巢、膀胱内或直肠后的血管处uPCC、PGL合称PPGL嗜铬细胞瘤2017-9-95Pheochromocytomaandparaganglioma:anendocrinesocietyclinicalpracticeguideline.[J].JournalofClinicalEndocrinology&Metabolism,2014,99(6):1915-42.n间歇性分泌儿茶酚胺及其代谢产物n在高血压病人中的患病率约为1%，占儿童高血压人群的1.7%n90%为良性且可通过切除治愈，恶性约为10%n发病高峰为30~50岁,男女发病率基本相同。n生前误（漏）诊率高达75%（美国MayoClinic尸检），约25%的嗜铬细胞瘤系影像学偶然发现嗜铬细胞瘤的生理特性儿茶酚胺及其代谢物Ø儿茶酚胺是一种含有儿茶酚（邻苯二酚）和胺基的神经类物质。包括多巴胺（DA）、去甲肾上腺素(NE)和肾上腺素(E)及它们的衍生物Ø儿茶酚胺中间代谢产物：甲氧基肾上腺素(MN)、甲氧基去甲肾上腺素(NMN)(合称MNs)、；终末代谢产物香草扁桃酸(VMA)和高香草酸（HVA）儿茶酚胺及其代谢产物检测简介2017-9-96儿茶酚胺的生理作用对心脏冠状血管的作用对呼吸系统的作用对胃肠道的作用对泌尿系统的作用对中枢神经系统的作用对内、外分泌腺的作用•使心脏兴奋，心肌代谢产物增加，提高冠状血管的灌注压力•心肌收缩力加强，心率加快，血压的收缩压增高，外周血流量增加•使呼吸频率加快、呼吸运动加深，并扩张支气管平滑肌•增加胃酸分泌，抑制胃肠蠕动•促进肾素分泌，引起醛固酮分泌增加，保钠保水，减少尿量•使膀胱壁、尿肌松弛，括约肌收缩，储尿量增加•兴奋中枢神经，提高警觉性，提高神经系统的反应速度•促进唾液、胃液、汗腺和支气管分泌，抑制胰腺分泌•促进肾上腺皮质激素、甲状腺激素、胰高糖素、胃泌素及红细胞生成素分泌增加；抑制胰岛素及降钙素分泌儿茶酚胺相关疾病肾上腺髓质嗜铬细胞瘤肾上腺髓质增生副神经节细胞瘤升高:见于嗜铬细胞瘤、神经母细胞瘤、肾上腺髓质增生、脑梗死、重症肌无力、进行性肌营养不良、继发性糖尿病、心肌梗死、精神分裂症、躁狂性精神病等；降低:见于帕金森病、癫痫、肾上腺切除后、风湿热、营养不良等。儿茶酚胺心脏并发症血管并发症左心室肥厚缺血性心脏病急性心肌梗死心力衰竭心源性休克心律失常血管内皮功能紊乱颈动脉内膜中层厚度增厚2017-9-97儿茶酚胺代谢物的临床意义《嗜铬细胞瘤和副神经节瘤诊断治疗的专家共识》，2016激素及代谢产物的测定是PPGL定性诊断的主要方法,包括测定血和尿NE、E、DA及其中间代谢产物甲氧基肾上腺素(MN)、甲氧基去甲肾上腺素(NMN)和终末代谢产物香草扁桃酸(VMA)浓度。“推荐诊断PPGL的首选生化检验为测定血游离MN、NMN，其次可检测血或尿NE、E、DA浓度以帮助进行诊断。”“Numerousindependentstudieshavenowconfirmedthatmeasurementsoffractionatedmetanephrines(i.e.normetanephrineandmetanephrinemeasuredseparately)inurineorplasmaprovidesuperiordiagnosticsensitivityovermeasurementoftheparentcatecholamines.”TheNANETSConsensusGuideline，2010儿茶酚胺及其代谢物的检测•常规的儿茶酚胺检测方法•原理：与合适的荧光衍生试剂（铁氰化钾）进行衍生化反应，生成可以发光荧光的物质，检测其强度•优点：线性好、简单、干扰小•缺点：前处理复杂、不能把集中成分完全分开、灵敏度低•常规的儿茶胺类检测方法•原理：使用放射性同位素氚标记的甲基供体将儿茶酚胺类转变成相应的氚标记的甲基衍生物，测定其放射强度•优点：灵敏度高，选择性好•缺点：前处理复杂，要严格控制测定和操作条件，技术难度高，检测的速度慢，结果滞后•常规的儿茶酚胺类检测方法•原理：采用强氧化剂直接氧化发光或者采用化学发光的催化剂、增敏剂或抑制剂产生化学发光，检测其发光强度•优点：设备简单、操作方便、分析速度快•缺点：前处理复杂、发光强度受环境影响很大、灵敏度低•一种儿茶酚胺类检测方法•原理：每一种物质都有一定的氧化还原电势，当对其施加一定的电势时，根据电势的变化测定物质的量•优点：灵敏度高、简便、高选择性•缺点:儿茶酚胺类易吸附在电极表面，导致电极表面钝化，工作电势效率必须达到100%•一种儿茶酚胺类的检测方法•原理：各组分发生电离，利用电场和磁场运动的离子，测定各个离子的质荷比，从而测定物质含量•优点：专属性强、灵敏度高、分析时间短、通量大•缺点：操作复杂、专业性强，成本较高荧光测定法放射酶学法化学发光法电化学分析法质谱法2017-9-98LendersJW,DuhQY,EisenhoferG,etal.Pheochromocytomaandparaganglioma:anendocrinesocietyclinicalpracticeguideline.[J].JournalofClinicalEndocrinology&Metabolism,2014,99(6):1915-42.串联质谱检测Time3.003.504.004.505.005.506.006.507.007.508.008.509.00%01003.003.504.004.505.005.506.006.507.007.508.008.509.00%01003.003.504.004.505.005.506.006.507.007.508.008.509.00%01003.003.504.004.505.005.506.006.507.007.508.008.509.00%01003.003.504.004.505.005.506.006.507.007.508.008.509.00%01003.003.504.004.505.005.506.006.507.007.508.008.509.00%01003.003.504.004.505.005.506.006.507.007.508.008.509.00%01003.003.504.004.505.005.506.006.507.007.508.008.509.00%01003.003.504.004.505.005.506.006.507.007.508.008.509.00%01003.003.504.004.505.005.506.006.507.007.508.008.509.00%0100CA_DER_Medium3_20170216_LP_110:MRMof1ChannelES+884.3170(E-884.3)1.31e5CA_DER_Medium3_20170216_LP_19:MRMof1ChannelES+870.3170(NE-870.3)9.45e47.85CA_DER_Medium3_20170216_LP_18:MRMof1ChannelES+853.3170(DA-853.3)7.97e5CA_DER_Medium3_20170216_LP_17:MRMof1ChannelES+838.7170.2(DHBA)3.02e58.378.20CA_DER_Medium3_20170216_LP_16:MRMof1ChannelES+667.3170(MN-D3)2.89e56.68CA_DER_Medium3_20170216_LP_15:MRMof1ChannelES+664.3170(MN)1.79e56.69CA_DER_Medium3_20170216_LP_14:MRMof1ChannelES+650.3170(NMN)6.76e46.105.84CA_DER_Medium3_20170216_LP_13:MRMof1ChannelES+435171(VMA-D3)6.15e42.81CA_DER_Medium3_20170216_LP_13:MRMof1ChannelES+435171(VMA-D3)6.15e42.81CA_DER_Medium3_20170216_LP_11:MRMof1ChannelES+416.1171(HVA)3.39e54.10NEEDAMNNMNVMAHVA2017-9-99线性标准曲线与定量下限化合物名称线性范围线性方程相关系数（R2）定量下限（nmol/L）VMA1.1-278.0y=0.0416x-0.0008380.99991.1HVA1.2-294.2y=0.0485x+0.0140.99931.2NMN0.12-255.3y=0.0597x-0.01170.9950.12MN0.12-271.7y=0.0300x+0.007440.9960.12NE0.14-257.1y=0.0265x-0.004060.9980.14E0.12-263.6y=0.0323x-8.819E-050.99940.12DA0.14-302.7y=0.223x+0.08870.99950.14日内与日间精密度:12%加样回收准确率：85%～115%精密度与加样回收2017-9-910临床病例n体检n影像学：CT发现右肾上腺区占位（嗜铬细胞瘤？）n血浆MN和NMN检测n术后病理：嗜铬细胞瘤2017-9-911临床病例——手术效果评估质谱技术在肺部结节良恶性早期诊断中的应用2017-9-912背景介绍（Background）l支气管肺癌（简称肺癌）是世界上发病率及死亡率最高的恶性肿瘤，每年死亡人数达140万，占所有恶性肿瘤死亡人数的18%；如果中国不及时控制吸烟和治理空气污染，到2025年每年新发肺癌患者将超过100万。—英国著名肿瘤学家Peto教授l2015年全中国肺癌新发病例为73.3万例，死亡61万例；l肺癌和肺部结节发病率持续增高；l需早筛查、早诊断、早治