遗传药理学例

前言华法林的缺点优点缺点治疗窗窄，难以掌握用药的合理剂量，易出现抗凝不足或过量作用时间长、服用方便、副作用小,价低预防和治疗血栓形成和复发华法林用途研究背景遗传药理学分子生物学基因个体化给药方案个体差异研究背景VKORC华法林无活性的凝血因子VitK环氧型由VKORC1编码有活性的凝血因子VitK氢醌型药物代谢酶CYP2C9*3研究目的本研究选取中国汉族人群为研究对象，探讨CYP2C9*3、VKORC1基因在中国汉族人群的分布情况，同时分析这些基因的多态性（遗传因素）以及患者的基线信息（非遗传因素）与华法林用药剂量之间的关系，以期建立适合中国汉族人群的华法林基因给药模型。材料与方法主要试剂DNA提取试剂盒DNA纯化试剂盒引物dNTP、buffer、Taq酶限制性内切酶琼脂糖Tris、硼酸、EDTA上海赛百盛基因技术有限公司TIANGEN上海英潍捷基贸易有限公司北京全式金生物技术有限公司FermentasGENETECHSunshine主要仪器F2-Q2型旋涡混合器台式高速离心机-20℃冰箱电子天平电泳仪PCR仪微量移液器DNA测序仪江苏泰县医疗器械厂EppendorfGermanyHairSartoriousUSABio-radAppliedBiosystems2720ThermoElectronABI3130x病例选择年龄大于18周岁，需要华法林治疗并要求维持INR在1.8~2.5之间；患者需要长期服用抗凝药华法林至少3个月以上，INR值稳定（连续3次复查INR均达到目标INR范围内）；中国汉族人。心功能Ⅲ级或以上；妊娠期及哺乳期妇女；近30天内参与其他干预试验者；长期合并应用与华法林有相互作用的药物者，如：三周内服用利福平者；因伴有合并症而不能使用标准剂量者（如：肝、肾功能不全等）。纳入排除实验流程样本取血（228例）目标基因片段PCR扩增（CYP2C9、VKORC1）纳入及排除目标病例收集病人的基线信息基因组DNA提取确定病例基因型伦理委员会，研究注册由遗传及非遗传因素建立华法林给药模型比较不同基因型个体用药剂量的差异数据统计实验内容采集患者信息基因分型基线信息DNA采集CYP2C9*3VKORC1确定基因类型PCR扩增基因的多态性与华法林用药剂量之间的关系实验内容比较不同种族间CYP2C9*3、VKORC1基因分布频率分析CYP2C9*3、VKORC1基因多态性与华法林维持剂量间的关系实验内容因变量为华法林日剂量（mg/d）自变量包括年龄、性别、身高、体重、CYP2C9、VKORC1基因型多元回归统计方法，制定给药模型统计学分析实验数据采用SPSS17.0统计软件分析应用基因计数法计算基因型频率和等位基因频率,基因频率和等位基因频率采用同组中构成比比较的χ2检验。患者与Hardy-Weinberg（H-W）平衡的符合程度采用χ2检验，P＞0.05样本具有群体代表性。计量资料数据采用mean±SD。不同基因型间华法林剂量比较采用t检验。P＜0.05，差异有统计学意义。结果与讨论表1CYP2C9*3基因分布频率（n=228，%）CYP2C9*3AAACCCCA基因型频率219（96.05）9（3.95）0（0.00）——等位基因频率———1.9898.02实验结果注：华法林抗凝治疗人群中，CYP2C9*3基因以AA型为主，AC和CC型少见表2患者CYP2C9*3基因多态性与H-W平衡的符合程度检验（n=228）基因型观察值期望值AA219219.08AC98.82CC00.09χ20.09—P＞0.05—表3不同种族CYP2C9*3基因型频率及等位基因分布频率对比（%）地区CYP2C9*3基因型频率CYP2C9*3等位基因分布频率AAACCCAC中国汉族[11.7.15]94.105.300.6097.003.00我国维吾尔族[16]80.322.6617.0281.6518.35美国[17]84.5814.740.6891.958.05意大利[18]80.9517.461.5989.6810.32俄罗斯[19]85.6013.980.4292.587.42本次研究96.053.950.0098.021.98表4VKORC1基因分布频率（n=228，%）VKORC1AAAGGGGA基因型频率191（83.77）35（15.35）2（0.88）——等位基因频率———8.5591.45注：华法林抗凝治疗人群中，VKORC1基因以AA和AG型为主，GG型少见表5患者VKORC1基因多态性与H-W平衡的符合程度检验（n=228）基因型观察值期望值AA191190.67AG3535.66GG21.66χ20.09—P＞0.05—表6不同种族VKORC1基因频率分布情况对比（%）研究人群AA型AG型GG型高加索人[20]中国汉族人[20]我国台湾[20]我国维吾尔族[21]日本[22]14.20-19.0079.8081.3074.0083.7039.50-56.0018.3018.7026.0015.5025.00-45.501.900.000.000.80本次研究83.7715.350.88表7不同基因型间的患者基本情况比较注：#CYP2C9*3AA和AC型华法林平均剂量比较，P＜0.05；##VKORC1AA和AG/GG华法林平均剂量比较，P＜0.05基因型（例数）年龄(age)体重（kg）身高（cm）平均日剂量(mg/d)CYP2C9*3AA（219）AC/CC（9）VKORC1AA（191）AG/GG（37）49.4±11.855.1±12.350.3±10.446.5±12.760.0±11.558.2±11.060.2±11.258.3±12.6162.3±8.0158.7±6.5161.7±7.8164.1±8.42.95±1.371.70±0.60#2.65±1.044.18±2.01##表8不同年龄段患者的华法林用药剂量比较患者情况年龄≥50(113)年龄＜50(115)P平均体重（kg）平均身高（cm）平均日剂量（mg/d）59.4±11.160.4±11.8＞0.05160.0±7.3161.2±8.0＞0.052.54±1.13.26±1.5＜0.05图1不同CYP2C9*3/VKORC1基因型患者间的剂量比较AAandAAAAandAGAAandGGACandAAACandAGn=183n=34n=2n=8n=1表9患者基线信息的单因素回归分析变量平均值相关系数P值性别（sex）年龄（age）身高（cm）体重（kg）CYP2C9*3VKORC10.001-0.0380.0350.008-1.2491.6440.994＜0.01＜0.010.309＜0.01＜0.01—49.65±11.87162.11±7.9559.93±11.42——表10多元回归统计方法制定给药模型方程R2P值Dose(mg/d)=1.39－0.034A＋0.021HDose(mg/d)=2.378－0.033A＋0.02H－0.992CDose(mg/d)=0.35－0.29A＋0.014H＋1.5VKDose(mg/d)=1.545－0.028A＋0.012H－0.955C＋1.495VKDose(mg/d)=-2.33＋0.306S－0.027A＋0.008W＋0.017H－0.063C＋1.501VK0.1210.140.3080.3260.334＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01结论本实验条件下：228例华法林抗凝治疗患者中，CYP2C9*3、VKROC1基因存在多态性，基因频率与其他种族存在一定的差异。CYP2C9*3基因突变的个体所需华法林的日平均剂量低于野生基因型的个体。VKROC1基因的突变导致患者服用华法林的剂量增加。非遗传因素中，患者的年龄、身高与华法林用药剂量存在相关性。本实验条件下：本研究得出的华法林个体化给药模型Dose(mg/d)=-2.33＋0.306Sex－0.027Age＋0.008Weight＋0.017Height－0.063CYP2C9*3＋1.501VKORC1可解释33.4%的剂量差异。本研究只能解释33.4%的华法林剂量差异，这提示我们要就影响华法林发挥抗凝活性的遗传及非遗传因素进行扩大研究。结论