高分辨溶解(HRM)分析

第二课高分辨溶解（HRM）分析[e-mail]高分辨率熔解（High-resolutionmelting，简称HRM）分析是一门新兴的技术。它仅仅通过PCR之后的熔解曲线分析，就能检测PCR片段的微小序列差异，从而应用在突变扫描、序列配对和基因分型等多个方面一、原理PCR扩增产物的熔解曲线完全取决于DNA碱基序列。序列中如有一个碱基发生了突变，都会改变DNA链的解链温度。但是这个差异极小，只有零点几摄氏度，如果仪器的分辨率不高，是根本无法检测的。HRM分析采用高精密仪器，在拥有饱和染料和高分辨率仪器之后，对PCR的扩增子进行加热，温度从50°C逐渐上升到95°C。在此过程中，扩增子逐渐解链，在到达熔解温度（Tm）时，DNA链分开，荧光强度迅速降低。在HRM分析的初期，荧光强度很高，随着温度升高，双链DNA逐渐减少，荧光强度也就下降了。HRM仪器通过照相机，记录下荧光变化的整个过程。通过对数据的作图，就生成了熔解曲线。双链DNA的熔解分析可追溯到上世纪六十年代，当时是通过紫外吸收来监测的。分析需要几微克的DNA，而样品以0.1-1.0°C/分钟的速率缓慢加热，常常要花上几个小时才能完成。后来，LightCycler定量PCR仪的出现，让荧光熔解分析变得流行。样品量因毛细管而缩减至纳克级，且熔解速率更快，达0.1-1.0°C/秒，这样熔解时间缩短至几分钟。当时使用的染料是SYBR®GreenI。双链DNA的熔解分析可追溯到上世纪六十年代，当时是通过紫外吸收来监测的。分析需要几微克的DNA，而样品以0.1-1.0°C/分钟的速率缓慢加热，常常要花上几个小时才能完成。后来，LightCycler定量PCR仪的出现，让荧光熔解分析变得流行。样品量因毛细管而缩减至纳克级，且熔解速率更快，达0.1-1.0°C/秒，这样熔解时间缩短至几分钟。当时使用的染料是SYBR®GreenI。但是当时这种熔解分析只能区分在片段大小和GC含量上差别较显著的DNA序列，比如检查PCR扩增产物中是否存在引物二聚体及其他非特异性的扩增。如果要区分SNP，分辨率还不够。饱和染料和非饱和染料非饱和染料对PCR有抑制作用，在实验中的使用浓度很低，远未将DNA双螺旋结构中的小沟饱和。这样，DNA双链高温变性时，单链部分的荧光染料分子发生重排，荧光染料分子重新结合到双链DNA的空置位点，造成荧光信号没有变化，因此出现假阴性，特异性下降饱和染料对PCR没有影响，高浓度的染料饱和了DNA双螺旋结构中的小沟，在DNA解链过程中就不会发生重排，这样熔解曲线才有了更高的分辨率。目前市场上的饱和染料主要有LCGreen、LCGreenPlus、SYTO9等几种HRM分析仪目前市场上有多个厂家提供HRM分析的仪器，包括IdahoTechnology、Corbett（QIAGEN）、Roche等，有些是专供HRM的仪器，有些则是附带HRM功能的定量PCR仪HRM的发明者—美国犹他大学医学院的Wittwer实验室曾评估了市场上多台仪器在基因分型和突变扫描上的性能。他们发现，对于大部分仪器的准确基因分型来说，主要限制在于平板上的空间温度差异（Tm的标准偏差为0.020-0.264°C）。其它差异如数据密度、信噪比和熔解速率，也会影响杂合体的扫描。经过比较发现，空气加热型仪器以及样品温度单独控制的仪器有着更低的Tm标准偏差（0.018-0.065），而加热块型仪器则在0.092-0.274。HR-1HR-1仪器是美国Idaho公司采用精确温度控制技术，并结合高速的数据采集技术，配合使用高分辨的饱和LCGreen荧光染料，使该仪器具有较高的灵敏度和特异性。分析时不消耗被测PCR产物样品，分析结束后PCR产物可用于下游的分析，如测序等。HR-1特点：•升温速率：0.01℃-1℃/秒•数据采集密度：100个数据/℃•使用LCGreen荧光染料•反应体系5-20ul•分析时间：40-45样品/小时（基于0.3℃/秒升温速率）HRM的应用领域1、基因的突变扫描：检测杂合子SNP、区段/碱基缺失、前后重复、杂合子缺失。相关研究方向：1）样本中特定突变位点（SNP）的筛查，包括一个片段中多个位点的复合杂合突变的Genotyping。2）疾病相关基因（癌基因）特定区段突变位点的扫描，新突变的发现。3）遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。4）植物抗逆性，突变与性状关联性的研究。5）动植物品质相关多态性位点的研究等。2、HLA(人类白细胞抗原)基因组配型器官移植的HLA配型、同胞之间HLA基因型确定，如快速确定HLA高度多态性位点的类型，及非亲源关系个体间异源造血干细胞移植前的HLA基因型确认。3、等位基因频率分析4、物种鉴定、品种鉴定1）微生物品种、物种快速鉴定。2）动植物品种鉴定。5、甲基化研究1甲基化位点的筛查。2甲基化程度分析。用HRM方法检测启动子区域内的甲基化，可检测低达0.1%的甲基化程度；并根据已知甲基化程度的标准曲线对未知样品的甲基化百分比进行测定。HRM是一种高灵敏度的甲基化检测方法，并且其高度的重复性和低成本将对肿瘤的研究和临床应用有很大帮助。6．法医学鉴定、亲子鉴定。检测单核苷酸多态性SNP鉴定，插入/缺失多态性DIP鉴定等将HRM用于法医学SNP、DIP鉴定，协助犯罪鉴定，亲子鉴定。相对于传统鉴定方法，HRM是一种简单、便宜、高通量的二等位基因分子标记鉴定的方法