第七章 动物生殖细胞工程

第七章动物生殖细胞工程主要内容性别控制体外受精技术显微受精第一节性别控制精子采集精子品质检查精液的稀释性别控制一、精子采集采精方法：假阴道法；手握法采精；电刺激法采精；按摩法采精采精频率：公畜每周采精次数二、精液品质检查外观：均匀,不透明,乳白色和灰白色,稍带有腥味射精量：公畜每次射精后的精液容量精子活率:直线前进运动精子数占总精子数的百分率精子密度：单位容积的精液所含精子数量形态检查：畸形率顶体完整率三、精液的稀释1.稀释液成分平衡盐类物质：电解质离子缓冲类物质：EDTA、柠檬酸钠溶液等能量物质：卵黄、奶类和单糖等冷冻保护剂：甘油、乙二醇和DMSO等抗生素：青、链霉素、庆大等。2.稀释液种类即用型：简单等渗液稀释即可。常温保存型：常用于短期保存，PH值较低。低温保存型：含卵黄、奶类等抗冷休克物质冷冻保存型：成分复杂，含糖、卵黄、抗冻剂等物质。四、性别控制1.意义人类对不同的动物有不同的性别选择需要。提高育种效率控制X精子的隐性遗传病2.性别决定机制多数动物的性别是由性染色体决定的。以人为例：XX——女；XY——男在人Y染色体短臂发现了一个单拷贝基因，称为Y染色体性别决定区基因（SexdeterminingregionYgene，SRY）Y染色体短臂上一段SRY基因决定人的性别。3.性别控制家畜性别控制的主要途径：受精前性别控制：选择X、Y精子控制受精条件：PH值及输精时间胚胎移植前性别控制：胚胎移植后性别控制：离心分离法电泳分离法免疫学分离法流氏细胞仪分离法核型分析法H-Y抗原法SRY-PCR鉴定法第二节体外受精技术体外受精：指两性配子在体外人工控制的环境中完成受精，使之融合形成合子的一种辅助性生殖技术。试管动物：将体外受精胚胎移植到母体后获得的动物。受精？授精？卵母细胞的获取与成熟精子的采集与获能受精过程和原理受精卵的体外发育培养胚胎移植体外受精的基本流程一、卵母细胞的获取与成熟生殖激素基础超数排卵卵母细胞获取的途径及方法卵母细胞的分级与筛选卵母细胞的成熟培养1.生殖激素基础发情周期：上次发情开始到再次发情开始时间生殖激素调节：下丘脑-垂体-性腺轴卵泡发育规律：募集-选择-优势化-排卵卵原细胞有丝分裂多个卵原细胞染色体复制初级卵母细胞MⅠ第一极体次级卵母细胞两个第二极体第二极体卵子退化消失卵子发生过程MⅡ胎儿期初情期后卵原细胞初级卵母细胞次级卵母细胞第一极体合子第二极体初级卵母细胞2.超数排卵定义：在雌性动物发情周期的间情期，注射外源促性腺激素诱发其卵巢大量卵泡同时发育并排卵超排激素：垂体促性腺激素（FSH、LH）、PMSG、hCG、PGF2α、GnRH等超数排卵的方法：①促卵泡素(FSH)减量注射法②孕马血清促性腺激素(PMSG)处理法3.卵母细胞的获取途径及方法成熟的卵母细胞:从输卵管中获取，直接用于体外受精未成熟的卵母细胞:卵巢中获取，体外成熟后用于体外受精小鼠成熟卵母细胞收集卵巢卵泡中抽卵4.卵母细胞的分级筛选A:外围有3层以上致密卵丘细胞，卵母细胞胞质均匀充满于透明带内B:外围有1~3层致密卵丘细胞，卵母细胞胞质均匀；C:卵丘细胞分散，卵母细胞胞质不均匀；D:无卵丘细胞，卵母细胞胞质不均匀，且有暗斑5.卵母细胞的成熟培养（核成熟和质成熟）卵母细胞选择:A级卵母细胞成熟培养液:基础培养液:TYH,TCM-199,DMEM等促性腺激素:FSH,LH,PMSG,HCG等类固醇激素:如雌激素等生长因子:如EGF、TGF等巯基类物质:半胱氨酸、谷胱甘肽等蛋白添加物:FBS或卵泡液（猪）成熟培养:采用微滴培养法：微滴的制作培养密度：10-15枚/100ul微滴成熟时间：小鼠12h，牛、羊20-24h，猪36-42h，人6h。1.精子的采集发生场所：睾丸时间：初情期——生殖机能衰老二、精子的采集与获能精原细胞有丝分裂初级精母细胞次级精母细胞精子细胞精子MⅠ第一阶段第二阶段第三阶段MⅡ精子发生的过程精原细胞染色体复制精子细胞——精子的形变过程概念：分子机制：促进精子体外获能的物质：方法：获能培养滴培养1-2h获能精子获能的检测：精子受精前经过复杂的生理生化变化而获得的穿入卵子的能力去除粘附在精子顶体区域的去能因子伴随细胞内蛋白质的磷酸化咖啡因肝素钙离子载体血清白蛋白2.精子获能运动能力检测异种穿卵能力检测氯四环素染色三、受精过程和原理成熟卵母细胞和获能的精子在特定的培养环境中共同培养，使之融合形成合子而完成受精过程。1.精卵受精过程精子穿入卵丘和放射冠精子与透明带结合顶体反应精子穿入透明带精卵融合卵子的激活精子核在卵胞质内的解凝聚原核形成原核的融合受精卵雌、雄原核的融合2.多精受精的原因受精浓度卵子未能完全成熟精卵作用时间，钙离子浓度等四、受精卵的体外发育培养将受精卵发育至桑椹胚或囊胚，因为移植这两个时期的胚胎才能获得较高的妊娠率，而且只有获得囊胚才能用于胚胎干细胞的分离培养。发育阻滞Bowman等（1970）发现了体外受精的哺乳动物早期胚胎存在着发育阻滞（developwentblock）现象，正好位于母体-胚胎基因过渡期。克服阻滞现象的方法改进培养液成分，改善培养条件中间受体培养法利用与体细胞或体细胞条件液建立共培养体系目前常用的共培养体系有：输卵管上皮细胞共培养体系颗粒细胞单层共培养体系早期胚胎发育质量的检测形态学检测：胚胎透明带完整，卵裂球大小均匀、紧密等。胚胎细胞计数：与体内发育至同期的胚胎的细胞数比较荧光染色法空气干燥法五、IVF技术的应用与展望卵母细胞成熟和早期胚胎发育机理研究动物胚胎生产构建生命科学技术的平台人类辅助生殖第三节显微受精概念显微受精的方法显微受精的影响因素显微受精的应用显微受精的安全性一、概念将体外受精与显微操作技术相结合，通过对哺乳动物精子和卵母细胞进行显微操作，使精子越过卵透明带和卵质膜所形成的正常受精屏障，促使其结合的一种新型的体外受精技术。二、显微受精的方法卵母细胞质内注射（ICSI）透明带下注射（SUZI）透明带钻孔（ZD）或透明带部分切口（PZD）用精子注射微管吸入制动后的精子用固定针吸住卵子，再以内含有精子的注射微细小管，将卵子的极体调整在6点钟或12点钟的位置。对准卵子三点钟的位置，将精子注入卵子内。完成ICSI（Intra-CytoplasmicＳpermInjection）三、显微受精的影响因素精子状态卵子的成熟卵母细胞激活卵子的损伤注射部位保证单精受精PVP浓度四、显微受精的应用前景：受精机理的研究治疗和改善人的生殖不育疾病五、显微受精的安全性损害卵子：胞质内精子注射可能损伤卵母细胞纺锤体，从而影响染色体分离而导致单倍体或三倍体胚胎的形成。缺陷遗传：ICSI在帮助精子穿越受精屏障时，也可能将男性不育因素（Y染色体长臂片段缺失或先天性双侧输精管缺失）传给下一代。第一个试管婴儿的诞生谢谢！小结基本概念：体外受精；性别控制；超数排卵；精子获能;顶体反应；了解性别控制的方法掌握卵泡发育规律：募集-选择-优势化-排卵掌握体外受精技术的基本流程理解卵母细胞的成熟过程理解精子获能的原理和方法掌握受精过程和原理理解显微受精技术作业解释名词：下丘脑-垂体-性腺轴、精子获能、体外受精、顶体反应、透明带反应、胞浆内精子注射简述体外受精的主要技术流程。简述性别控制的主要方法何谓精子稀释，良好的稀释液应具备哪些作用？下丘脑-垂体-性腺轴▲▲胚胎性别鉴定的方法（P333）细胞遗传学方法（核型分析法）通过查明胚胎细胞的性染色体类型为XX型和XY型来鉴定胚胎的性别。操作过程：取少量的胚胎细胞经秋水仙素处理固定染色，检查性染色体，根据染色体在细胞分裂中期不同的谱带和Y染色体的大小形态来判定性别，这种方法准确率几乎可达到100%。▲免疫学方法：H-Y抗原法间接免疫荧光法：先将8细胞桑葚胚期的胚胎与H-Y抗体反应30min，再与异硫氰酸盐荧光素（FITC）标记的免疫球蛋白IgM抗体反应，然后在荧光显微镜下检查胚胎是否带有荧光素，若有则判定为H-Y+胚胎，反之为阴性胚胎。细胞毒性分析法：H-Y抗血清与补体加入培养液中对胚胎进行培养，将在培养过程中继续发育的胚胎为H-Y-（雌性），将出现个别卵裂球溶解，以及不能发育到囊胚期的为H-Y+（雄性）。▲分子生物学方法（SRY-PCR鉴定法）这种方法是一种利用雄性特异性基因探针和PCR扩增技术鉴定胚胎性别的方法。原理：在SRY基因核心序列的两侧设计并合成一对特异性引物，分别互补于扩增序列的两条链，在TaqDNA聚合酶和胚胎细胞DNA存在的条件下，经高温变性，低温退火和链延伸三个步骤进行DNA扩增，将靶序列扩增至上百万倍以上，经电泳检测扩增结果，能扩增出SRY序列的为雄性，反之为雌性。▲超排激素的生理作用FSH（促卵泡素）：刺激卵泡颗粒细胞增生和膜层迅速生长发育，与黄体生成素合用，促进卵泡成熟和排卵。LH（黄体生成素）：与促卵泡素协同促进卵泡成熟，引起排卵，形成黄体。PMSG（孕马血清促性腺激素）：主要表现卵泡刺激素样作用，促使卵泡的发育与成熟，也有轻度的黄体生成素样作用。hCG（人绒毛膜促性腺激素）：主要作用与黄体生成素相似，也有较弱的卵泡刺激素样作用。PGF2a（前列腺素）：溶解黄体，使孕酮产生减少或停止。▲（1）促卵泡素(FSH)减量注射法：牛超数排卵示意图▲（2）孕马血清促性腺激素(PMSG)处理法在发情周期的11～12d，一次肌注PMSG2500～30001U，48h后宫注PGF2α2.4mg。发情后约18h肌注等量的抗PMSG。▲