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测定花青素、多糖对自由基清除的协同作用实验方案一、原理多糖(polysaccharides)是由许多相同或不同的单糖以α-或β-糖苷键所连接而成的结构复杂的生物大分子化合物。20世纪60年代以来，人们逐渐发现多糖具有多种生物活性，如抗肿瘤、免疫、降血糖和降血脂等，而且对机体几乎无毒副作用。它广泛存在于动植物和微生物细胞壁中。原花青素(proanthocyanidins)是由单体黄烷-3-醇类物质以不同聚合度连接而成的多酚类化合物，研究表明，原花青素具有广泛的生化和药理活性，如抗氧化、清除自由基、护肝解毒、抗菌及抗癌等功能，目前已经成为医药、保健品的重要原料及食品、化妆品的重要添加剂，它广泛存在于各种植物的核、皮或种籽中二、材料、仪器和试剂1.材料：黑枸杞,2017年由静乐县提供2.试剂：二苯代苦味肼基自由基(DPPH)、儿茶素标准品;原花青素PC对照品（源自葡萄籽,纯度95%）;香草醛,大孔吸附树脂HPD-200A、HPD-400A、HPD-700,聚酰胺30-60目;葡聚糖凝胶SephadexLH-20;色谱级甲醇、乙腈、醋酸;甲醇、乙醇、盐酸、硫酸、石油醚、丙酮、甲酸、冰乙酸、三氯乙酸、正己烷、正丁醇、乙酸乙酯、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、葡萄糖、蒽酮、茚三酮、苯酚、考马斯亮蓝、氯化钠、三氯化铁、氯化亚铁、氯化钾、无水氯化钙、碘化钾均为国产分析纯。3.仪器：粉碎机,分析天平,超纯水机,旋转蒸发仪,冷冻干燥机,真空干燥箱,紫外分光光度计,PB-10酸度计,BT-100恒流泵,DL-5M冷冻离心机,HH-6电热恒温水浴锅,恒温鼓风干燥箱,7200型可见光分光光度计,超声波清洗器,JR-2集热式磁力搅拌器,高效液相色谱仪,高速冷冻离心机,气质联用仪,层析柱(2.5cm×50cm)三、实验过程：参照1.材料的预处理：将黑枸杞放于烘箱中40℃条件下烘4h，取出用粉碎机粉碎，后置于干燥器中备用。2.提取方法：1)准确称取一定量黑枸杞粉于100mL具塞三角瓶中，在超声功率400W、料液比为1:70（g:ml）、乙醇浓度40%、反应温度60℃等条件下提取30min，冷却至室温2）离心(5000r/min，10min，常温)，取上清液，3）经旋转蒸发(60℃)浓缩至1/10体积左右，然后加入4倍体积的体积分数95%乙醇，搅拌均匀后置4℃冰箱中12h，4)离心(5000r/min，10min，4℃)，得上清液(原花青素粗提物)和沉淀物（多糖）。3.多糖、花青素得率的计算1）多糖得率的计算a)标曲的制作：称取干燥至恒重的葡萄糖标准品10mg，用去离子水定容到50mL，配成0.2mg/mL的葡萄糖溶液，分别从中移取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL定容到10mL，以蒸馏水为空白对照，取上述溶液1.0mL，加入5mL蒽酮试液，冰浴5min，后置沸水浴10min，取出后用自来水冷却2min，静置10min后在627nm处测定其吸收值。b)样品得率的测定以葡萄糖浓度为纵坐标，吸光度值为横坐标，做回归处理，得回归方程。将上述粗提取得到的沉淀物用去离子水溶解并定容到50mL，即为待测样，以标准曲线法计算多糖含量。多糖提取率/%=(C×V/1000m)×100式中:c，从回归方程中计算得出的多糖的浓度(mg/mL);V，多糖定容体积(mL);m，黑枸杞样品的质量(g)。2）原花青素提取率计算a)标曲的制作：称取2.5mg原花青素标准品，体积分数60%乙醇定容到5mL，然后吸取0.5，0.6，0.7，0.8，0.9mL定容到5mL，分别从中抽取1mL加入2.5mL1%香草醛-60%乙醇溶液和2.5mL浓盐酸，避光，30℃水浴30min，以60%乙醇为空白对照，在500nm处测定吸收值。b)样品得率的测定以原花青素浓度为纵坐标，吸光度值为横坐标，做回归处理，得回归方程。吸取上述粗提取得到的上清液1mL，以标准曲线法计算原花青素含量。原花青素提取率/%=(C×V/1000m)×100式中:c，从回归方程中计算得出的原花青素的浓度(mg/mL);V，待测样总体积(mL);m，黑枸杞样品的质量(g)。4.分别测定黑枸杞花青素、多糖对自由基的清除作用a)DPPH标准曲线的绘制：准确称量0.025gDPPH于小烧杯中,加入适量蒸馏水和3ml甲醇溶解，再于100mL容量瓶中用蒸馏水定容，即得1000μmol/LDPPH标准溶液。将1000μmol/LDPPH标准溶液用蒸馏水分别稀释成100、200、400、600、800μmol/L的DPPH溶液。用移液枪分别吸取0、100、200、400、600、800、1000μmol/L的DPPH溶液各200μL于已加入7.8mLDPPH甲醇液的10mL棕色容量瓶中。混匀后，将其置于室温暗处反应60min，然后在515nm处测定残留DPPH自由基吸光值。对照组设置为200μL甲醇溶液代替标准液。根据DPPH标准溶液浓度与已知浓度的DPPH标准液对DPPH自由基的抑制率绘制标准曲线。b)DPPH自由基清除能力评价根据Brand、William等的方法并略做修改。用分析天平准确称取0.0025gDPPH，再用少量甲醇溶解并于100mL棕色容量瓶中用甲醇定容，避光保存，即得100μmol/LDPPH工作液。吸取4.8mLDPPH工作液于试管中，加入0.2mL原花青素提取液（避光），混匀，避光反应60min后，在515nm下测定残留DPPH自由基吸光值，每个试验平行重复三次。抑制率：X=（1-[DPPH]t/[DPPH]t=0）×100式中：[DPPH]t=0表示0时刻体系中DPPH·的起始浓度；[DPPH]t表示t时刻体系中DPPH·的浓度。以各样品的浓度对DPPH的清除率作图，可以得到各样品对DPPH清除率达50%时所需各样品的量，即IC50值。四、综合比较，花青素、多糖单独存在时的IC50以及黑枸杞多糖与花青素的复配物的IC50得出多糖、花青素对自由基清除的协同作用。五、参考文献[1]李丹丹,梁英,杨宏志,朱磊.葡萄籽原花青素提取工艺的研究[J].中国食品添加剂,2017(08):55-62.[2]白海娜.黑木耳多糖AAP-4与原花青素对辐射诱导氧化损伤协同防护作用[D].哈尔滨工业大学,2016.[3]余红军,李立祥,倪媛,袁芳,王晓莉,孙海洋.油茶籽壳中多糖和原花青素的超声波提取工艺[J].食品与发酵工业,2010,36(08):194-197.[4]孙涛,付雪艳,张蓓,董琳.DPPH法测定沙棘籽原花青素清除自由基的能力[J].宁夏医科大学学报,2009,31(01):26-28.[5]李春阳,许时婴,王璋.DPPH法测定葡萄籽原花青素清除自由基的能力[J].食品与生物技术学报,2006(02):102-106.