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微生物学实验生物工程类实验要求课前充分预习，上课不无故缺席，实验报告要及时上交。实验期间不得大声喧哗、服从老师的安排、注意安全。实验器材专人专用，对仪器要爱护，损坏实行赔偿制度。实验菌种和物品未经许可，不得携出室外，用后的菌种按老师要求妥善处理。维护好实验室的环境卫生，实行值日生制度。实验报告要求统一用A4纸手写实验报告封面格式1、实验课程名称2、实验项目名称3、学生所在的专业、班级、姓名、学号4、实验日期5、同组者姓名实验报告格式1、实验目的2、实验原理3、实验仪器、溶液试剂4、实验步骤5、实验结果（如绘图、列表等）6、思考题实验成绩的组成平常成绩30％（实验操作表现、实验报告）操作考试30％笔试成绩40％实验内容土壤中微生物的分离纯化与活菌计数显微镜的使用及酵母菌、放线菌的形态观察霉菌的形态观察油镜的使用、细菌的单染色和革兰氏染色微生物大小测定、显微镜直接计数法微生物生理生化反应水中细菌总数和总大肠菌群的测定微生物的紫外诱变（一）培养基的制备与灭菌实验一、土壤中微生物的分离纯化与活菌计数一、培养基的制备目的要求明确培养基的配制原理通过对基础培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤按培养基的用途分基础培养基鉴别培养基选择培养基按培养基的物理状态分固体培养基半固体培养基液体培养基按成分不同分天然培养基合成培养基半合成培养基基本原理培养基的配方牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（一种天然培养基，用于分离和培养细菌）配方：牛肉膏3g蛋白胨10g氯化钠5g琼脂20g水1000mlpH7.2-7.4灭菌121℃20min高氏Ⅰ号培养基（一种合成培养基，可用于培养放线菌）配方：可溶性淀粉20gKNO31gNaCl0.5gK2HPO40.5gMgSO40.5gFeSO40.01g琼脂20g水1000mlpH7.2～7.4灭菌121℃20min固体淀粉培养基（一种鉴别培养基，用于大分子物质水解的生理生化鉴定）配方：蛋白胨10g氯化钠5g牛肉膏5g可溶性淀粉2g蒸馏水1000ml琼脂15～20g灭菌121℃20min器材溶液或试剂4mol/LNaOH，1mol/LHCl，各类培养基的配方药品。仪器或其他用具试管，三角瓶，搪瓷杯，量筒，天平，药匙，电磁炉，高压蒸气灭菌锅，pH试纸(pH5.5～9.0)，硅胶塞，棉花，报纸，记号笔等。操作步骤（一）1．计算：根据配方按照用量计算。2.称量：3．溶解：如有琼脂，要不断搅拌避免糊底。4、调节pH：用1mol/LNaOH或1mol/LHCl调节，以pH试纸或pH计测定。5．过滤：趁热用四层纱布过滤。操作步骤（二）6.分装试管：固体不超过试管高度的1/5；液体、半固体不超过试管高度的1/4或1/3。三角烧瓶：总体积的一半为限。管口或瓶口不得沾有培养基操作步骤（三）7.加塞1.正确；2.管内部分太短，外部太松；3.外部过小操作步骤（三）8.包扎：注明培养基的名称。9.灭菌：按各自培养基灭菌的温度、时间灭菌。10.搁置斜面(1/3～l/2，不能超过1/2)。11.无菌检查实验无菌器皿的准备无菌水：在试管或三角瓶内量取实验所需的自来水，经121℃20min灭菌。无菌移液吸管、培养皿：报纸包扎后，经121℃20min灭菌。了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。目的要求二、消毒与灭菌灭菌是指杀死一切微生物的营养体，芽孢和孢子。消毒则指消灭病原菌和有害微生物的营养体，因而只是部分灭菌。消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、照射和使用化学药品等方法。基本原理干热灭菌火焰灼烧法干热灭菌法（烘箱内热空气灭菌法）湿热灭菌法加压蒸汽灭菌法紫外线灭菌法微孔滤膜过滤除菌火焰灼烧法直接在火焰上灼烧灭菌主要用于实验室接种针(环)、试管口、三角瓶口和金属小工具等的灭菌。干热灭菌法设备：电热烘箱适用于耐高温器皿，160-170℃，维持2小时注意事项：1.温度不可超过180℃，以防玻璃器皿上的棉塞及包装纸烤焦着火。2.灭菌时物品不宜堆放得太紧，以免妨碍空气流通。3.灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。4.电烘箱内温度＜70℃时，方可打开箱门，以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。2.湿热灭菌(一）高压蒸汽灭菌法：是将物品放在高压蒸汽灭菌锅内0.1MPa，121℃保持15～30min进行灭菌，从而导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化，以达到彻底灭菌为准。此法适用于培养基、工作服、橡皮物品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。原因一：湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低。卵白蛋白含水量/%30分钟内凝固所需温度/℃50562574~801880~9061450160~170蛋白质含水量与凝固所需温度的关系原因二：湿热的穿透力比干热大。原因三：湿热的蒸气有潜热存在。温度/℃时间/h透过布层的温度/℃灭菌干热130~1404867270.5不完全湿热105.33101101101完全在同一压力下，含有空气的蒸汽所达到的温度低于饱和蒸汽的温度，所以排气是否完全很重要。间歇灭菌法：应用于不易于高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等。此法是用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行灭菌，每天加热100℃30min、连续三天，可彻底灭菌。煮沸消毒法：注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。一般煮沸消毒时间为10～15min。超高温杀菌：此法指在温度和时间标准分别为135～150℃和2～8s的条件下对牛乳或其他液态食品进行处理的一种工艺。2.湿热灭菌(二）高压蒸汽灭菌法操作步骤（三）手提式高压蒸汽灭菌锅全自动数显立式高压蒸汽灭菌锅操作步骤（三）（以手提式高压蒸汽灭菌锅为例）1.装锅先向外层锅内加入适量的水，放入内锅，装入待灭菌物品。2.加盖将盖上的排气软管插入内层灭菌锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，勿使漏气。3.灭菌加热，并同时打开排气阀，待冷空气完全排尽后，关上排气阀，升温至l21℃时维持15~20min。4.降温取物灭菌结束后，切断电源，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，开盖取物。加压蒸汽灭菌法0.1MPa，121℃，20min灭菌注意事项：1.切勿忘记加水，加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。2.锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。3.压力一定要降到“0”时，才能打开排气阀，开盖取物。4.灭菌全程必须有人看守。紫外线灭菌法适用于无菌室、接种箱、手术室内的空气及物体表面的灭菌。紫外线灯距照射物以不超过1.2m为宜。若紫外线照射与3%~5%的石炭酸溶液或2%~3%的来苏尔等化学消毒剂结合使用，可加强灭菌效果。注意事项：紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不能直视紫外线灯光，更不能在紫外线灯光下工作。过滤除菌法适用于不耐热的液体物质（如维生素、血清、酶等热敏性物质）。滤膜孔径：≤0.22μm缺点：无法去除培养液中的病毒和噬菌体。思考题培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？在配制培养基的操作过程中应注意哪些问题？为什么？在干热灭菌操作过程中应注意哪些问题,为什么？——P27（1）为什么干热灭菌比湿热灭菌所需的温度高，时间长？请设计干热灭菌和湿热灭菌效果比较方案。——P27（2）在高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降低“0”时才能打开排气阀，开盖取物？——P27（3）