实验一-PCR引物设计

实验一PCR引物设计姓名：温馨学号：103220年级：大二专业：生物技术日期：2012/3/18一、实验目的1、掌握PCR引物设计的原则。2、学会使用PCR引物设计的软件。二、实验工具OLIGO,DNAMAN三、实验原理聚合梅链式反应（polymerasechainreaction）即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。PCR技术已成为分子生物学研究中使用最多，最广泛的手段之一，而引物设计是PCR技术中至关重要的一环，使用不合适的PCR引物容易导致实验失败。现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。引物设计原则如下：1、引物应在模板cDNA的保守区域设计并具有特异性，与非扩增区无同源序列，这样可以减少引物与基因组的非特异结合，提高反应的特异性。2、引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应3、引物GC含量在40%~60%之间，GC含量过高或过低都不利于引发反应，上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。4、引物中四种碱基要随机分布，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在，尤其3’端不应超过3个连续的G或C，因为这样会使引物在GC富集序列区域错误引发。5、引物自身不应存在连续4个碱基的互补，否则引物自身会折叠成发夹结构，从而影响引物与模板的复性结合。两引物之间也不应具有连续4个碱基的互补，以防止引物二聚体的形成。6、在引物5’端添加酶切位点时要注意目的序列内不得含有相同的酶切位点，同时在酶切位点外侧加上保护碱基。四、实验步骤1、打开oligo软件，点击file中的open选项，打开所要用的序列。首先设计上游引物，上游引物序列与已有cDNA序列相同，从起始密码子开始选取大约24个碱基作为引物，方向为5’端到3’端，在5’端添加酶切位点和保护碱基。2、把设计好的引物序列在oligo软件中进行分析。首先选择duplexformation，即二聚体的分析，尽量避免二聚体形成，可改动个别不重要的碱基。第二项为hairpinformation，即发夹结构分析，与二聚体相同，也不应有过多碱基互补。第三项为compositionandTm，看GC含量在40%~60%之间，Tm在55~80℃之间。第四项为falseprimingsites，即错误引发位点，要使错误引发效率在100以下。3、下游引物的设计与上游引物类似，与已有的cDNA序列互补，从终止密码子开始选取24个碱基，方向为5’端到3’端，在5’端添加酶切位点和保护碱基。分析方法同第二步。五、实验结果基于公司合成的Dsk1基因，分别合成3条正向引物和1条反向引物，分别对应3个不同长度的片段：N+M;sN+M;M（s代表small，即sNeck是neck的一部分；扩增三段不同长度基因片段以分别研究其对于蛋白质功能的影响）sNeck+MoterNeckMotor公司合成的Dsk1基因序列序列：1260bp基因序列（Lifetech编号：12GS0046）ATGAATGCAGCCAATCGTCGTAAAAGCACCAGCACCGTTGGTATTACCGGTCGTAAAGATGCAACCCGTATGAAAATTGAGCAGATGGAAAAAGAACGTAAAGAACGCCGTAAAACCATGATGCAGCGTAAAGAAGCACGCAAACAAGAACACATGAAAAACATTGAAGCAGGCAATCCGGGTGATGTGGATTTTATTGGTCTGGTTGAAGAATGGCGTCGTGAACAAGAAAACAAAATCGGTGATAAAAGCCCTCCGAGCCTGTTTGCAAGCACCAATAGCAATATTTGTATTGCCGTTCGTAAACGTCCGATCAGCGATAAAGAACGTCAGAAACTGGATCATGATAGCGTTAGCTGCTTTCAGAATAAAGTGTGGATTCATAGCGCCAAACTGAAAGTTGATGGCATCACCAAATATCTGACCCATAATAGCTTTCAGCTGGATCATACCTTTGGTGAAGATAGCACCACCGAGCAGATTTATCTGGCAACCACCCTGCCGCTGGTTGATCATGTTGTTAGCACCCAGGGTCGTGCAACCGTTTTTTGTTATGGTCAGACCGGTAGCGGTAAAACCTATACCATGAATGGTATTCAGCAGATCCTGGCCTATGATCTGTATGGTCAGCTGGCAGAACATACCGATGATCTGGAAATTACCGTTGCCTTTTTTGAACTGTATAGCGGTAATGTTCTGGACCTGCTGCATGGTTGTCAGCGTTGTAAACTGCTGGAAGATGGTAATGGTGAAGTTAATATCACCGGTCTGCGTGAAGTTCCGGCACCGACACCGGAAGCATTTCTGCAGGTTATTGAAGAAGGTCATAGCCTGCGTACCACCCAGAAAACCGAAGCAAATGATGCAAGCAGCCGTAGCCATGCAATTTGTCAGGTTTTTCTGCGTGATTATGGTGGTAATCTGCGTGGTAAACTGGGTCTGGTGGATCTGGCAGGTAGCGAACGTGGTAGCGATACCAAACAGCATAATAGCCAGCGTCGTACCGAAAGCGCAGATATTAACACCAGCCTGCTGGCACTGAAAGAATGTATTCGTGCACTGGGTCAGAAAAGCGCACATGTTCCGTATCGTGGTAGCAAACTGACCCTGATCCTGAAAGATTGTTTTAGTCCGGATAGCAAAACCACAATGGTTGCCACCGTTAGTCCGGGTGCAAGCGCAGCAGATCATTCACTGAATACCCTGCGTTATGCAGATCGTATTAAAGAACAGCGTGTTAGCAGCAATGGTCAGCGTGGT我们所设计的四条引物：FulllengthN-terminal:MGNAANRRKS5’GCTACGATCCATGGGAAATGCAGCCAATCGTCGTAAAAGC3’sN+MN-terminal:MGKEARKQEH5’CTGCGAGACCATGGGAAAAGAAGCACGCAAACAAGAACAC3’MotorN-terminal:MGPPSLFAST5’CTGATAGACCATGGGACCTCCGAGCCTGTTTGCAAGCACC3’Cterminal:5’TGCTATGACTCGAGACCACGCTGACCATTGCTGCT3’Ps：我们选择的载体是质粒，在由限制性核酸内切酶修饰过的质粒DNA序列中插入外源的目的基因，以质粒为载体，将目的基因通过转化或转导的方法导进宿主细胞，进行重组、筛选、扩增。质粒是细菌或细胞染色质以外的双链共价闭合环形DNA，能自主复制，是能独立复制的复制子，对宿主生存并不是必需的。