基因工程及其在食品科学中的应用

第二章基因工程及其在食品科学中的应用基因工程基础基因工程研究方法基因工程在食品科学中的应用第一节基因工程基础一、基因工程的定义、意义及研究内容（一）基因工程的定义geneengineeringgeneticengineeringrecombinantDNAtechniqueMolecularcloning（二）基因工程的意义基因工程是现代生物工程的主体核心技术。基因工程的最大特点是可打破生物种属界限，进行生物种(属、科、目、纲、门、界)内外基因的重组、遗传信息的转移。遗传病、心脑血管病、糖尿病、癌症过度肥胖综合症、老年痴呆症、骨质疏松症（三）基因工程的研究内容制备目的基因构建重组DNA获得转化体筛选出重组转化体阳性克隆筛目的基因在受体生物细胞中高效表达隆二、基因工程的工具酶基因工程的关键技术之一就是先将目的基因DNA从供体生物体中分离出来，再与合适载体DNA连接重组等，这些分子操作涉及多种不同的酶。主要包括：限制性内切核酸酶DNA甲基化酶、DNA聚合酶依赖于DNA的RNA聚合酶连接酶激酶磷酸酶核酸酶（一）限制性内切核酸酶与DNA甲基化酶1、定义restrictionendonuclease：指一类能够识别和切割双链DNA分子内核苷酸序列的内切核酸酶DNAmethylase：是指一类能够识别DNA特定序列，并在其特定碱基的特定位置上引入甲基而发生修饰作用的酶2、限制性酶（甲基化酶）的命名和分类(1)限制酶(甲基化酶)的命名其命名主要是参照H．O．Smith和D.Nathans提出的待命名酶的供体微生物的属名与种名相结合的原则进行的，具体如下：①以属名的第一个字母(大写)和种名的最前两个字母(小写)组成的三字母符号为其基本形式如：来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)的酶用Eco表示；来源于流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)的用Hin表示②当同属不同种的两种微生物的种名前两个字母完全相同时，则来自后一种微生物的酶的符号改用其种名词头前缀后第一个字母(小写)代替上述三字母符号中的最后一个字母如：来自Haemophilusparainfluenzae(副流感嗜血杆菌)的用Hpa表示，．而来自同一属的Haemophilusparahaemolyticus(副溶血嗜血杆菌)的则用Hph表示。③当微生物具有特殊名称时，则将代表该特殊名称的符号置于上述三字母符号之后如：来自Haemophilusinfluenzae的Rd株的用Hind表示；来自Haemophilusinfluenzae的Rf型的用Hinf表示。④当不止一种限制酶(甲基化酶)分离纯化自同一微生物株系时，则依其被分离的先后顺序以罗马数字(大写)置于上述命名符号之后如：来自Haemophilusaegytius的三种酶分别用HaeI、HaeⅡ和HaeⅢ表示；来自Haemophilusinfluenzae的Rd株的三种酶分别用HindI、HindⅡ和HindⅢ表示。⑤为了区别起见，在上述命名名称之前加R．表示限制酶类；在上述命名名称之前加M．表示甲基化酶类如：来自Haemophilusinfluenzae的Rd株的第三种限制性内切核酸酶为R.HindⅢ，其相应的DNA甲基化酶则为M.HindⅢ。大鼠生长激素基因转入小鼠(2)限制酶的分类根据酶的性质，可将限制酶分为三个类型:I型:三种不同亚基组成；辅助因子为ATP、Mg2+及S-腺苷甲硫氨酸其切割位点距其识别位点至少1000bp；且切割作用是随机的Ⅱ型:两个相同亚基组成；辅助因子仅为Mg2+；其识别位点常具旋转对称性；其切割位点与其识别位点重叠或在其附近；且切割作用特异性强Ⅲ型:两种不同亚基组成；辅助因子为ATP和Mg2+，也受S-腺苷甲硫氨酸激活，但并非必需；其切割位点一般在距其识别位点3’端24～26bp处PstI5’-CTGCA↓G-3’3’-G↑ACGTC-5’HpaI5’-GTT↓AAC-3’3’-CAA↑TTG-5’限制性内切酶的旋转对称性需要指出的是，I型和Ⅲ型限制性内切核酸酶均兼具限制酶活性和甲基化酶活性；而对Ⅱ型限制性内切核酸酶而言，其只具限制酶活性，与其相应的DNA甲基化酶才具甲基化酶活性。Ⅱ型限制性内切核酸酶及其相应的DNA甲基化酶对DNA有相同的识别序列。(3)Ⅱ型限制性内切核酸酶的基本特性①识别序列与切割位点Ⅱ型限制性内切核酸酶可识别长度为4～7bp的双链DNA特定序列，该识别序列(识别位点)常呈旋转对称性②切割方式平齐末端、5’—磷酸端2～5个核苷酸突出单链黏性末端、3’-羟基端2～5个核苷酸突出单链黏性末端5´3´3´5´●●●●●●●●●●●●●5´3´3´5´5´突出——3´突出——平端——5´3´3´5´Ⅱ型限制性内切核酸酶切割方式③同裂酶与同尾酶isoschizomer：在Ⅱ型限制性内切核酸酶中，来源不同而识别序列和切割方式均相同者如：HpaⅡ和MspI两者的识别序列都是CCGG，切割方式也相同，因此二者为同裂酶isocaudamer：来源及识别序列不同，但DNA经其切割后能形成相同黏性末端者如：BamHI、BclI、BglⅡ、MboI、Sau3AI及XhoⅡ切割DNA后都形成相同的GATC四核苷酸突出单链黏性末端，因此其为一组同尾酶需要指出的是，由同尾酶切割DNA所得到的黏性末端可以彼此连接起来，但是不能重新切开，即原来同尾酶的识别序列都已不再存在。④限制性片段长度与切割频率经限制性内切核酸酶切割后产生的DNA片段称为限制性片段(restrictionfragment)。一般不同限制酶切割DNA后所形成的限制性片段长度不一假设在某DNA分子中，A或T出现的频率为X，G或C出现的频率为Y，那么某限制酶在该DNA分子上的切割位点出现频率(切割频率或位点频率)F可用下式表示：F=XnYm式中：n——该限制酶识别序列中双链A=T碱基对的数目；m——该限制酶识别序列中双链G=C碱基对的数目如果构成某DNA分子的碱基对总数目(B)及某限制酶识别位点核苷酸序列均为已知，那么该限制酶在该DNA分子上的理论切割位点数目(N)为：N=BF假定在某DNA分子中四种核苷酸残基数量相等，那么识别序列为四个碱基对的限制酶在该DNA分子中切割位点出现频率为(1／4)4，即1／256，也即平均256个碱基对出现1个切割位点。同样，识别序列为六个碱基对的限制酶在该DNA分子中切割位点出现频率为(1／4)6，即1／4096，也即平均4096个碱基对出现1个切割位点。需要指出的是：实际情况与理论不相符(4)影响限制性核酸内切酶活性的主要因素及优化策略①底物DNA制备物的纯度：蛋白质、SDS、EDTA、酚、氯仿、乙醇及高浓度的盐离子等污染物都会抑制限制酶的活性。②底物DNA的甲基化程度：大肠杆菌的绝大多数菌株含有两种DNA甲基化酶：a、dam甲基化酶；b、dcm甲基化酶。③底物DNA的结构构型：环状双螺旋DNA较线性DNA稳定。因此，在用限制性酶酶解同样分子量的DNA时，环状双螺旋DNA所需酶量为线性DNA的10~20倍。④酶反应缓冲液的组成：⑤酶反应的最适温度：为了提高限制酶对底物DNA低纯度制备物的反应效率，一般采用如下方法：a增加限制酶的用量(平均每µg底物DNA可用10IU甚至更多些)；b延长酶催化反应的保温时间，使酶解更完全；c扩大酶催化反应的体积，使潜在的抑制因素被稀释，以减弱其抑制作用；d在反应液中加入适量亚精胺(一般应用浓度为1～2.5mmol／L)，以利限制酶对基因组DNA的酶解作用。(5)限制性内切核酸酶酶解反应的操作步骤及注意要点(二)DNA聚合酶最常用的依赖于DNA的DNA聚合酶有大肠杆菌DNA聚合酶I(全酶)、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)、T4噬菌体编码的DNA聚合酶、耐热的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)等依赖于RNA的DNA聚合酶，即逆转录酶，优先以RNA为模板，也可以DNA为模板，因此该聚合酶能以RNA为模板催化合成双链DNA1、大肠杆菌DNA聚合酶I(全酶)来源：大肠杆菌；分子量：109×103的多肽链（1）作用①具有5’→3’DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以带3’自由羟基的DNA片段为引物；②5’→3’外切核酸酶活性，从5’端既降解双链DNA，也降解RNA-DNA杂交体中的RNA链(RNA酶H活性)；③3’→5’外切核酸酶活性，底物为带3’自由羟基的双链DNA或单链DNA。（2）主要用途①以切刻平移法(nicktranslation)标记DNA。在所有聚合酶中，只有该酶能用于此反应，因为只有其具有5’→3’外切核酸酶活性。②对DNA分子的3’突出尾进行末端标记。DNA聚合酶Ⅰ2、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)来源：由大肠杆菌DNA聚合酶I全酶经枯草杆菌蛋白酶酶解获得，也可通过克隆技术获得。分子量：76×103的多肽链（1）作用①5’→3’DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以带3’自由羟基的DNA片段为引物；②3’→5’外切核酸酶活性，底物为带3’自由羟基的双链DNA或单链DNA。（2）主要用途①补平限制酶切割双链DNA所产生的3’凹端；②如果以标记的dNTP补平双链DNA的3’凹端，那么可对DNA分子进行末端标记；③对DNA分子的3’突出尾进行末端标记；④在cDNA克隆中，合成cDNA第二链；⑤应用Sanger双脱氧链末端终止法进行DNA测序。Klenow酶的作用方式3、T4噬菌体DNA聚合酶来源：T4噬菌体感染的大肠杆菌分子量：114×103（1）作用①5’→3’DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以带3’自由羟基的DNA片段为引物；②3’→5’外切核酸酶活性，底物为带3’自由羟基的双链DNA或单链DNA；（2）主要用途①补平限制酶切割双链DNA产生的3’凹端；②如果以标记的dNTP补平双链DNA的3’凹端，那么可对DNA分子进行末端标记；③对DNA分子的3’突出尾进行末端标记，并且该酶为利用此法进行此类末端标记的首选酶；④将双链DNA的突出端转化成平齐端。在制备与合成接头连接的双链DNA时，经常利用这一特性。4、TaqDNA聚合酶来源：水生栖热菌(Thermusaquaticus)，现可由基因工程途径来生产分子量：65×103，是一种非常耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶。（1）作用具有5’→3’DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以带3’自由羟基的DNA片段为引物。（2）主要用途①对DNA进行测序；②通过聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)对DNA分子的特定序列进行体外扩增。5、逆转录酶(依赖于RNA的DNA聚合酶)来源：一种来自禽成髓细胞瘤病毒(AMV)，分子量为170×103；一种来自能表达克隆化的Moloney鼠白血病病毒(Mo-MLV)逆转录酶基因的大肠杆菌，分子量为84×103。（1）作用（2）主要用途6、末端脱氧核苷酸转移酶(末端转移酶)来源：小牛胸腺分子量：60×103（1）作用（2）主要用途(三)依赖于DNA的RNA聚合酶1、SP6噬菌体RNA聚合酶来源：SP6噬菌体感染的鼠伤寒沙门氏菌LT2株。（1）作用该酶主要具有一种活性，即5’→3’RNA聚合酶活性，识别双链DNA模板上相应的噬菌体特异性启动子，并且以此双链DNA为模板合成RNA。（2）主要用途①合成单链RNA，制备杂交探针；②合成单链RNA作为体外翻译系统中的功能性mRNA或体外剪接反应的底物。2、T7或T3噬菌体RNA聚合酶来源：T7或T3噬菌体感染的大肠杆菌。（1）作用该类酶主要具有一种活性，即5’→3’RNA聚合酶活性，识别双链DNA模板上相应的噬菌体特异性的启动子，并以此双链DNA为模板合成RNA。（2）主要用途①合成单链RNA，制备杂交探针；②合成单链RNA作为体外翻译系统中的功能性mRNA或体外剪接反应的底物；③利用带有T7噬菌体启动子的载体在大肠杆菌和酵母中表达克隆化基因。(四)连接酶、激酶及磷酸酶DNA连接酶(DNAligase)：是指将两段DNA拼接起来的酶