基因工程及其应用

基因工程及其应用第2节基因工程：即。通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，地改造生物的。原理：操作水平：结果：基因重组DNA分子水平定向地改造生物的遗传性状，获得人类所需要的品种。基因拼接技术或DNA重组技术定向遗传性状•培育转基因大肠杆菌的简要过程：你认为上述培育转基因大肠杆菌的关键步骤有哪些？普通大肠杆菌(不能分泌胰岛素)人体组织细胞提取胰岛素基因与运载体DNA拼接导入大肠杆菌(含胰岛素基因)转基因大肠杆菌(能分泌胰岛素)•培育转基因大肠杆菌的关键步骤：1.ONE胰岛素基因从人体细胞内提取出来2.TWO胰岛素基因与运载体DNA连接3.THREE胰岛素基因导入受体(大肠杆菌)细胞基因的“剪刀”基因的“针线”基因的运载体1、基因的“剪刀”—限制性核酸内切酶专一性：识别特定核苷酸序列，在特定的切点切DNA，具特异性。作用于：磷酸二酯键，结果：产生两个黏性末端。二、基因操作的工具CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTGGCATCTTAAAATTCCGTAG练习使用EcoRI剪切目的基因CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTGGCATCTTAAAATTCCGTAG目的基因黏性末端2.分子针线—DNA连接酶(DNAlinking-enzyme)积极思考DNA连接酶连接的是两个脱氧核苷酸(deoxyribonucleotide)分子的什么部位？基因操作(geneengineering)的工具（2006.台州质检）下列是由限制酶切割形成的DNA片段，能用相应DNA连接酶将它们恢复连接的组合是①…CTGCA…G②…G…CTTAA③G…ACGTC…④AATTC…G…A.①③；②④B.①②；③④C.①④；②③D.以上都不对A使用DNA连接酶制作重组DNA分子甲片段CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATT乙片段GGCATCTTAAAATTCCGTAG重组DNA分子RecombinantDNAGGCATCTTAAAATTCCGTAGDNA连接酶的作用是：A.子链和母链之间形成氢键B.黏性末端之间形成氢键C.两个DNA末端间的缝隙连接D.A、B、C都对C3、基因的运载体（2）条件①能够在宿主细胞中复制并稳定地保存②具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接③具有标记基因，便于进行筛选如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。、（3）常用的运载体：质粒、噬菌体和动、植物病毒等（1）运载体的概念标记基因，便于进行检测。其中质粒存在于许多细菌和酵母菌等生物中,是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子.（4）它们的共同特点是都有侵染或进入宿主细胞的能力从细胞中分离出DNA从大肠杆菌中提取质粒限制酶提取目的基因限制酶目的基因与运载体结合DNA连接酶目的基因导入受体细胞目的基因的表达与检测三、基因工程操作的基本步骤第一步：获取目的基因1、直接分离基因——鸟枪法该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能将真核生物的基因转移到原核生物中去。有两种方法：①逆转录法：以信使RNA为模板，在逆转录酶的作用下利用脱氧核苷酸合成DNA(基因)。②化学合成法：根据蛋白质的氨基酸顺序推算出信使RNA核糖核苷酸顺序，再据此推算出基因DNA的脱氧核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因。⑵人工合成基因法第二步：目的基因与运载体结合注意：要用同一种限制酶切取目的基因和运载体，并用DNA连接酶连接。基因的针线：DNA连接酶GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCGGCTTAAAATTCG用同种限制酶切割第三步：将目的基因导入受体细胞1、常用的受体细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌、动植物细胞等2、常用微生物作受体细胞的原因：微生物增殖快、代谢快、目的产物多(1)检测的意义：鉴别目的基因是否真正导入受体细胞。(2)检测方法：大肠杆菌质粒具有抗青霉素基因（标记基因），只要检测受体细胞具有抗青霉素的能力，就说明导入了目的基因。(3)目的基因的表达：受体细胞表现出特定性状，说明目的基因导入和完成表达过程。目的基因的检测和表达第四步:⒈要使目的基因与对应的运载体重组，所需的两种酶是()①限制酶②连接酶③解旋酶④还原酶Ａ．①②Ｂ．③④Ｃ．①④Ｄ．②③2.基因工程的正确操作步骤是（）①使目的基因与运载体结合②将目的基因导入受体细胞③检测目的基因的表达是否符合特定性状要求④提取目的基因Ａ．③②④①Ｂ．②④①③Ｃ．④①②③Ｄ．③④①②1、基因工程与作物育种苏云金杆菌转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转鱼抗寒基因的番茄转基因耐贮藏番茄（左）和普通番茄（右）不会引起过敏的转基因大豆生长快、肉质好的转基因鱼(中国)乳汁中含有人生长激素的转基因牛(阿根廷)中国农业大学获得的转基因克隆奶牛导入人基因具特殊用途的猪和小鼠2、基因工程与药物研制我国生产的部分基因工程疫苗和药物许多药品的生产是从生物组织中提取的。受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。胰岛素从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！使其价格降低了30%-50%!干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药”！过去从人血中提取，300L血才提取1mg！其“珍贵”程度自不用多说。人造血液、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产，均为解除人类的病苦，提高人类的健康水平发挥了重大的作用。人造血液及其生产乙肝疫苗我国生产的部分基因工程药物和疫苗我国生产的部分胰岛素产品•拓展题：•1.人与细菌是差异非常大的两种生物，为什么通过基因重组后，细菌能够合成人体的某些蛋白质呢？这是因为基因水平上，人和细菌的遗传机制一致：1.遗传物质都是DNA2.共同使用一套密码子3.都遵循中心法则四、基因工程的应用1、基因工程与作物育种2、基因工程与药物研制3、环境保护：实例：抗虫植物、耐盐碱棉花、转基因奶牛、超级绵羊等。培养抗虫植物的意义：成本低、污染少胰岛素、干扰素、白细胞介素等净化石油的超级细菌从细胞中分离出DNA从大肠杆菌中提取质粒限制酶提取目的基因限制酶目的基因与运载体结合DNA连接酶目的基因导入受体细胞目的基因的表达与检测三、基因工程操作的基本步骤3．质粒是基因工程中最常用的载体，它存在于许多细菌体内。某细菌质粒上的标记基因如右图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上生长情况也不同，右图示外源基因在质粒中可插入的位置有a、b、c点。某同学根据实验现象对其插入的位点进行分析，其中分析正确的是实验现象实验推论在含青霉素培养基上生长情况在含四环素培养基上生长情况目的基因插入的位置A能生长能生长aB不能生长能生长bC能生长不能生长CD不能生长不能生长CB2．(2010·江苏生物，27)下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。请回答下列问题：限制酶BamHⅠHindⅢEcoRⅠSmaⅠ识别序列及切割位点G↓GATCCCCTAG↑GA↓AGCTTTTCGA↑AG↓AATTCCTTAA↑GCCC↓GGGGGG↑CCC(1)一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割前后，分别含有________个游离的磷酸基团。(3)用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割，原因是________________________________________。(4)与只使用EcoRⅠ相比较，使用BmaHⅠ和HindⅢ两种限制酶同时处理质粒、外源DNA的优点在于可以防止___________________________________________0、2SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化(5)为了获取重组质粒，将切割后的质粒与目的基因片段混合，并加入________________酶。(6)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是为了_____________。(7)为了从cDNA文库中分离获取蔗糖转运蛋白基因，将重组质粒导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体，然后在__________________的培养基中培养，以完成目的基因表达的初步检测。DNA连接鉴别和筛选含有目的基因的细胞蔗糖为唯一含碳营养物质解析：本题综合考查基因工程的过程及应用。(1)质粒是双链环状DNA分子，在SmaⅠ切割前没有游离的磷酸基团，SmaⅠ作用于两个核苷酸之间的磷酸二酯键，切割产生的DNA片段末端是平末端，因而质粒经切割后含有2个游离的磷酸基团。(3)据图1可知，SmaⅠ切割的位点在抗生素抗性基因之中，抗生素抗性基因是标记基因，应尽量避免破坏，据图2可知SmaⅠ切割的位点在目的基因之中，破坏了目的基因，所以不能使用SmaⅠ切割。(4)用同种限制酶切割后的质粒和目的基因，在基因表达载体构建时，常形成三种连接方式，其中目的基因与目的基因的连接、质粒与质粒的连接是无效的连接，用两种限制酶可避免此类现象。(5)基因表达载体的构建过程中需加DNA连接酶，连接脱氧核糖和磷酸。(6)抗生素抗性基因属于标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。(7)目的基因是蔗糖转运蛋白基因，将其导入丧失吸收蔗糖能力的大肠杆菌突变体后，应进行目的基因的检测与鉴定，可根据受体细胞是否含有蔗糖转运蛋白，即是否具备吸收蔗糖的能力判断基因工程是否成功，因而可在含有蔗糖(唯一碳源)的培养基中培养。