光学显微镜基础知识

奥林巴斯生物显微镜光学显微镜基础知识•显微镜的光学原理•象差•显微镜的技术参数•显微镜的光学部件基础知识显微镜成像FF’物镜显微镜成像FF’物镜显微镜成像物镜250mm＝明视距离FF’目镜基础知识光学显微镜基础知识•显微镜的光学原理•像差•显微镜的技术参数•显微镜的光学部件理想成像点标本投影图像点平面平面图形准确相似图形像差实际图形点标本投影图像虚的圆平面弯曲的面图形变形的图形像差象差的种类•球差•象散•慧差•畸变•场曲•色差基础知识象差球差象散慧差场曲负畸变正畸变基础知识场曲基础知识基础知识ACHPLANACH场曲ＡＣＨＰＬ色差基础知识色差校正对照色差校对无校对校对基础知识光学显微镜基础知识•显微镜的光学原理•像差•显微镜的技术参数•显微镜的光学部件显微镜的技术参数•数值孔径•分辨率•工作距离•焦深•放大倍率•同焦距•同轴度基础知识数值孔径(N.A)基础知识分辨率基础知识ΔR=kλ/NAΛ：波长NA：数值孔径K常数:K光镜=0.61；KFV=0.51数值孔径大分辨率高基础知识NA与焦深基础知识工作距离(W.D)基础知识工作距离不需要盖玻片有盖玻片同焦距（齐焦距离)基础知识同轴度基础知识比如10倍物镜下的中心转换到40倍是仍然几乎是中心柯勒照明和临界照明基础知识临界照明柯勒照明基础知识厚标本和薄标本4-5um2um基础知识基础知识光学显微镜基础知识•显微镜的光学原理•像差•显微镜的技术参数•显微镜的光学部件显微镜的主要光学部件•物镜•目镜•聚光镜基础知识物镜基础知识物镜的种类按色差和场曲校正程度分:•消色差物镜（Ach)•平场消色差物镜(PlanAch)•平场半复消色差物镜(Plan-FL或PLFL）•平场复消色差物镜（PlanApo)•平场超级复消色差物镜（PlanSApo)基础知识VIS－NIR范围内优异的色差校正信噪UPLSAPO物镜消色差Ach–蓝(486nm)和红(657nm)半复消色差Fluorite–兰和红+(绿,紫色(437nm))复消色差Apo–437-657nm超级复消色差SuperApo–430-1000nm物镜的色差校正轴向色差侧向色差ACH消色差Ach–蓝(486nm)和红(657nm)半复消色差Fluorite–兰和红+(绿,紫色(437nm))复消色差Apo–437-657nm超级复消色差SuperApo–430-1000nm物镜的色差校正轴向色差侧向色差ACHFLIRIR消色差Ach–蓝(486nm)和红(657nm)半复消色差Fluorite–兰和红+(绿,紫色(437nm))复消色差Apo–437-657nm超级复消色差SuperApo–430-1000nm物镜的色差校正轴向色差侧向色差ACHFLApo消色差Ach–蓝(486nm)和红(657nm)；绿球差半复消色差Fluorite–兰和红+(绿,紫色(437nm))；绿、兰球差复消色差Apo–437-657nm，绿、兰、深兰球差超级复消色差–430-1000nmSuperApo物镜的色差校正轴向色差侧向色差ACHFLSApoIRIRApo消色差物镜基础知识复消色差物镜半复消色差物镜传统物镜的符号基础知识新物镜的符号基础知识其它物镜基础知识浮雕相称物镜无应力偏光物镜相称物镜超低倍物镜带校正环物镜基础知识对载波片和盖玻片厚度的要求基础知识载玻片:0.9-1.4mm盖玻片:0.17mm无盖片物镜基础知识物镜光阑的运用光阑全开启光阑适当关小——荧光观察中应用目镜基础知识目镜的视场基础知识F.N.22标本的视场直径标本的视场直径=目镜视场数/物镜倍率例:WH10X目镜视场数为22物镜为UPLFL40X视场直径=22÷40=0.55mm基础知识聚光镜显微镜的调节•瞳距调节•屈光度调节•光路转换•聚光镜中心•孔径光栏设置瞳距调节屈光度调节调节光路转换100%80%20%100%聚光镜中心调节⑤光轴中心调节螺钉③视场光阑③孔径光阑②10X物镜①标本④聚光镜升降旋钮孔径光栏调节N.A聚=(0.6-0.8)N.A物孔径光栏开度与图象100%70%30%HRLCHCLRMRMC孔径光栏的运用孔径光栏的运用对比度调节奥林巴斯显微镜无限远光学系统——UIS显微镜无限远光学系统——UIS有限远无限远UIS光学系统MeritoftheInfinitysystem物镜D/M重影平行光线结像透镜UIS系统UniversalInfinitySystem————万能无限远系统1.完美结合分辨率和对比度-明场高分辨率-高对比度、高亮度图像-清晰的DIC图像-更敏感的偏光观察-清晰、色彩明亮的相衬UIS系统UniversalInfinitySystem2.系统灵活性-无限远校正光学系统-物镜和结像透镜完全校正3.物镜万能性更强-AsingleuniversalobjectivelensperformsverywellinFluorescence,NomarskiDIC,Phasecontrast,Polarizedlightand,ofcourse,Brightfield-HighUVtransmission,Strain-free,PerfectcorrectionofChromaticaberrationandotheropticalaberrationsCompetitioncomparisonｆ（TL）物镜校正齐焦距离OLYMPUSUIS180Ｆ45Nikon　CFI60200Ｆ60ZEISSICS160Ｔｃ45LeicaDHC200Ｔｃ45F:FullyPrimaryCorrectioninobjective&tubelensTc:Tube-lensCompensation奥林巴斯显微镜无限远光学系统——UIS1增加附件，光路不变，倍率不变，F.N.不变2中间附件设计更简单，不需增加透镜3物镜单独完成象差校正，象差校正更高，不需目镜补偿4更高镜像亮度，荧光效果更好（结象透镜校正）5接视频效果更好，不需增加照相目镜相差观察方式1原理利用被检物体的光程（折射率x厚度）差进行镜检，即利用干涉现象，将相位差变为人眼可以分辨的振幅差共轭面：吸收光线，直射光通过补偿面：相位推迟，衍射光通过物镜相板聚光镜环状光阑相差观察方式2特点鉴定活体细胞最实用、最经济的方法3缺点需要光强高切片不能太厚(2~10um)盖片、载片需符合标准最好配用单色滤光镜操作较麻烦荧光效果不如明场物镜相差观察方式4应用：无色透明活体标本的细微结构，检查,鉴定活体细胞(培养细胞,分离细胞)相差观察方式5调节：柯勒照明调节将相差物镜及附件转入光路（物镜－聚光镜相衬环型号匹配）对样品聚焦取下目镜，装上CT望远镜，调节CT焦距看到清晰的相差环调节聚光镜上定位螺丝，使环状光阑象与相板共轭面重合荧光观察方法什么是荧光?•物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光——冷光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。•显微镜荧光利用光源激发——光化荧光荧光显微镜的作用原理宽谱线发射光（汞灯）滤掉其他光，透过激发光激发滤色片吸收滤色片滤掉激发光，透过荧光标本受激发产生荧光向四周发散激发光受反射、折射或衍射向四周发散荧光的性质•吸收光，必需有激发光源•荧光波长＞激发波长（损失热能）•荧光强度极小于激发光的强度•有不同程度的衰减•荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率荧光显微镜的优点和用途优点：•检出能力高（放大作用）•对细胞的刺激小（可以活体染色）•能进行多重染色用途：•物体构造的观察——荧光素•荧光的有无、色调比较进行物质判别——抗体荧光等•发荧光量的测定对物质定性、定量分析荧光显微镜的主要部件透射式•吸收滤色镜•暗场聚光镜•激发滤色镜•汞灯光源落射式•吸收滤色镜•分光镜•激发滤色镜•汞灯光源落射荧光显微镜的构造吸收滤色镜激发滤色镜落射荧光显微镜的构造荧光显微镜光源•汞灯光源:提供激发光(U、V、B、G)•氙灯光源：高峰值更宽，更稳定荧光显微镜激发透镜组•激发滤色镜:激发波长选择•激发透镜组（激发块）:T%nmBANDPASS入射光发射光激发滤色镜分光滤色镜吸收滤色镜落射荧光显微镜各部件特性和作用•吸收滤色镜:荧光透过,阻挡杂光•分色镜:反射激发光,荧光透过＞A透过A＜A反射B＞B透过＜B阻挡nmnmT%T%A滤色镜的选择荧光素激发波长发射波长DAPI372456AMCA350450Hoechst33258365465FITC490520AcridineOrange490590AcridineYellow470550CY3552565TRITC541572PropidiumIodide530615荧光素的特性滤色镜的特性激发分色吸收带宽对图象的影响SWB:BP420-480WB:BP450-480WIB:BP460-490NB:BP470-490FITC+PI双重染色标本的单色和双色观察WUWIBDUALBANDWIBAWIGWIBDAPI+FITCFITC+PI单色滤色镜的特性曲线现行显微镜特点和各种滤色镜油镜应使用荧光油物镜光栏的运用光栏全开启光栏适当关小减少杂散光干扰汞灯灯箱构造灯室，上下、左右旋钮，聚光镜旋钮