1_基因工程的基本概念-2012

基因工程生物技术专业课程基因工程523416789基因工程的基本概念基因工程的基本原理基因工程所需的基本条件基因工程的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建大肠杆菌基因工程酵母基因工程哺乳动物基因工程高等植物基因工程1.4基因工程实验方法及步骤1基因工程的基本概念1.3重组DNA技术与基因工程的基本用途1.2基因工程的基本定义1.1重组DNA技术的基本定义1.5基因工程的基本形式1.1重组DNA技术的基本定义1基因工程的基本概念重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。1.2基因工程的基本定义1基因工程的基本概念广义的基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。狭义的基因工程的定义:在分子水平上，提取（或合成）不同生物的遗传物质，在体外切割，再和一定的载体拼接重组，然后把重组的DNA分子引入细胞或生物体内，使这种外源DNA（基因）在受体细胞中进行复制与表达，按人们的需要繁殖扩增基因或生产不同的产物或定向创造生物的新性状，并能稳定遗传给下代。基因工程又名遗传工程（geneticengineering）DNA重组（recombinantDNAtechnique）分子克隆（molecularcloning）基因克隆（genecloning）基因工程的核心包括基因克隆和基因表达。目的基因的获得（PCR技术）连接到表达载体形成重组DNA分子转化到动物、植物及微生物（大肠杆菌）或其它表达系统蛋白质的提取纯化及功能鉴定筛选重组克隆，培育个体，鉴定动物及植物优良性状1.2.1基因工程主要技术：1.从细胞和组织中分离DNA。2.利用能识别特异DNA序列的限制性内切核酸酶(restrictionendonucleases)酶切DNA分子，或PCR方法制备基因片段。3.将酶切的基因片段与载体DNA连接，构建重组DNA分子。4.将载体与基因片段构成的重组DNA分子导入宿主细胞后，该重组DNA分子能在细胞内复制，产生多个完全相同的拷贝，即克隆(clones)。5.重组DNA能随宿主细胞的分裂而分配到子细胞，使子代群体细胞均具有重组DNA分子的拷贝。6.能从宿主细胞中回收、纯化和分析克隆的重组DNA分子。7.克隆的基因能转录成mRNA、翻译成蛋白质。能分离、鉴定基因产物。1.2.2基因工程的开端1953年4月25日，英国《自然》杂志发表了沃森和克立克的文章“核酸的分子结构—DNA的一个结构模型”。标志着DNA双螺旋结构的建立，从此，遗传学和生物学的历史从细胞阶段进入了分子阶段。JDWatsonFHCCrickFSangerWGilbert桑格（英国化学家）最早测定胰岛素的氨基酸顺序获得1958年诺贝尔化奖。22年后，他因测定了一种噬菌体的一级结构获1980年的诺贝尔化学奖。吉尔伯特在DNA测序领域，因其卓越的工作获得1980年诺贝尔化学奖。PaulBerg伯格（美国生物化学家）通过把两个不同来源的DNA连结在一起并发挥其应有的生物学功能，证明了完全可以在体外对基因进行操作。他作为“重组DNA技术之父”于1980年获诺贝尔化奖。1985年穆利斯发明了高效复制DNA片段的聚和酶链式反应（PCR）技术，利用该技术可从极其微量的样品中大量生产DNA分子，使基因工程获得了革命性发展。KBMullis1972年美国斯坦福大学的P.Berg研就究小组使用限制性内切核酸酶(restrictionenzymes)EcoRI对病毒Sv40DNA和λ噬菌体进行酶切，然后用T4DNA连接酶将两种片段连接起来,第一次在体外获得包括Sv40DNA和λ噬菌体的重组DNA分子。1973年S.Cohen将两种分别编码卡那霉素(kanamycin)和四环素(tetracycline)得抗性基因相连接，构建出重组DNA分子，转化大肠杆菌，获得既抗卡那霉素又抗四环素双重抗性特征得转化子菌落，基因工程由此诞生。1975年建立单克隆抗体技术1978年大肠杆菌表达出胰岛素1988年PCR方法1997年英国克隆多利羊1.2.3基因工程的发展1.人类基因组计划主要内容是完成人体23对染色体的全部基因的遗传作图和物理作图，完成23对染色体上30亿个碱基的序列测定以美国为主、包括英国、法国、日本和中国多国科学家参加的国际合作计划，是迄今为止在生命科学领域最宏大的研究计划。1995年，科学家们获得了人类第3、第16和第22号染色体的高密度物理图。1999年12月1日，科学家们宣布，人类第22号染色体，含3.34×107个碱基序列的测定已经全部完成，这是人类完成的第一条人类自身染色体的全序列测定。2000年6月26日，人类基因组工作框架图完成，标志着功能基因组时代的到来。1.2.4已完成测序工作的生物酵母线虫果蝇拟南芥2000年4月5日:以杨焕明为首的中国科学家在Science发表了水稻全基因组框架序列图。基因总数：46022~55615，约为人类的2倍；其中10000个基因的功能已确定；水稻的“垃圾”序列多位于基因外，人类的“垃圾”序列多位于基因内；水稻的基因平均长度为4500bp,人类基因平均长度为72000bp,拟南芥约有25000个基因，80%在水稻中都存在，二者之间有关信号传导的基因差别最大2000年3月塞莱拉公司宣布完成了果蝇的基因组测序。2000年12月14日英美等国科学家宣布绘出拟南芥基因组的完整图谱。这是人类首次全部破译一种植物的基因序列。2001年:1、2月，HGP和美国塞莱拉（Sequencing）公司将各自测定的人类基因组工作框架图分别发表在Nature和Science上，这表明人类基因组计划（HGP）进入了一个展新的阶段。1.2.5正在进行或即将完成测序工作的生物美国科学家《自然》杂志上公布了一只１２岁大斗拳狗的完全基因组图谱，该图谱将有助于理解一些特定基因的演化，并将促进对人类和犬类共患疾病的研究。美国研究人员09年11月19日宣布完成了玉米的全基因组测序工作，玉米共有10对染色体，约3.2万个基因，23亿个碱基对，是目前已测序的植物中基因数量最多的品种。85%的碱基序列是重复的。国际马类基因组序列计划（theinternationalHorseGenomeSequencingProject）宣布，科学家们首次完成家马（(Equuscaballus)）的基因图谱草图，得到了270万个DNA碱基对的数据。英国曼彻斯特大学牵头的国际科研小组破译出了曲霉菌、米曲霉素和烟曲霉素三种霉菌的基因组序列并绘制出基因图。普渡大学开展大豆基因组研究计划非典型性的Haemophilusinfluenzae致中耳炎病菌株的测序工作家猫、马铃薯、海藻、牛基因组测序工作美国科学家在21日出版的《自然》杂志上公布了常见的稻瘟病菌的基因组草图，这是科学家首次完成植物病原体的基因测序。腔棘鱼是腔棘鱼科的一种大部分已灭绝的鱼。最近，由斯坦福大学的RichardMyers博士与Benaroya研究所的ChrisAmemyiya博士合作领导的研究组破解了一种“活化石”鱼类——腔棘鱼的遗传密码。细菌Dehalococcoidesethenogenes的基因组进行了测序，这种细菌有清除地下水中由干洗和制造计算机的化学物质所造成的污染的能力。美国国家卫生研究院(NIH)的美国人类基因组研究所(NHGRI)，宣布将与位于墨尔本的AustralianGenomeResearchFacilityLtd.(AGRF)进行合作计划。他们将为澳洲最有名的动物—袋鼠，进行基因测序的计划。中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所等6个单位最近完成的《痢疾杆菌全基因组序列测定与分析》科研课题，从分子水平对我国流行的痢疾病原菌优势菌株——福氏2a痢疾杆菌301株的致病机理和耐药机制进行了研究。取得了一系列具有原创性的科研成果。美国、加拿大、新西兰，以及澳大利亚在内的4个国家为奶牛基因组的测序工作筹措了总数达5300万美元的资金。科学家新近对一种昆虫病菌的基因组进行了测序，并分析获得了这种被称为P.luminescens的细菌的全部基因组顺序。这项研究成果发表于2003年11月号《自然-生物技术》。该成果可能为控制害虫带来新方法。1992年，酵母3号染色体DNA的全部315357个碱基序列的测定，这是人类完成的第一条真核生物染色体DNA的全序列。1996年，科学家们完成酵母其他15条染色体的碱基序列测定。1997年，大肠杆菌基因组序列测定宣告完成。科学家们对人类基因组的性质和作用的认识在不断地深化。未来：健康领域、基础科学研究领域……1.2.6后基因组学研究(post-genomics)是在完成基因组图谱构建以及全部序列测定的基础上，进一步研究全基因组的基因功能、基因之间的相互关系和调控机制为主要内容的学科。后基因组学主要利用DNA微列阵技术、蛋白质组学、酵母菌双杂交系统以及生物信息学等技术相结合，对已知的基因组序列进行研究。主要有:转录组学研究:从mRNA水平来研究基因组的基因表达，分析基因表达水平、数量、以及在不同组织和发育阶段表达差异。蛋白质组学研究:蛋白质组学(proteomics)是从蛋白质水平来研究基因组的基因表达，分析基因组的蛋白质类型、数量、空间结构变异以及相互作用的机制。在蛋白质分析中，目前主要利用奥佛诺(OFarrel，1975)发明的据蛋白质的等电点和分子量分析蛋白质的双向电泳技术，来分析蛋白质组(proteomes)，1.2.7生物信息学研究生物信息学(bioinformatics)是利用计算机贮存原始资料，分析生物信息，将DNA芯片以及蛋白质双向电泳结果转变成为可读的遗传学信息的学科。生物信息学是将现代生物技术与计算机科学结合，收集、加工和处理生物资料。具体来说，它是将数学、统计学、计算机方法结合起来，用于综合、分类、分析和阐述生物信息的科学。194619501955196019651949Hbs贫血1953双螺旋1966遗传密码1975DNA杂交1977DNA测序1987G剔除小鼠1989位置克隆1990第一个基因治疗现代分子遗传学发展重要事件194619501955196019651970197519801985199019951956HbsGlu-Val第一个R酶1972重组质粒1981转G小鼠1983HD病G定位1985PCR1986位置克隆1995细菌G组序列1996酵母基因组序列1944DNA是遗传物质1.3重组DNA技术与基因工程的基本用途1基因工程的基本概念1.3.1分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源1.3.2大规模生产生物活性物质1.3.3设计、构建生物的新性状甚至新物种1.3.1大规模生产生物活性物质工程细胞基因工程蛋白质工程途径工程发酵工程细胞工程分离工程酶酶工程分离工程野生细胞野生细胞生物活性物质乳汁中分泌人凝血因子IX的转基因山羊美国转基因猪，其体内含有人类的基因，乳汁含有人体蛋白fatorⅧ。只需300～600只这样的母猪就能满足全世界对这种蛋白的需求。1.特殊蛋白质的大量生产人胰岛素从猪和牛的胰脏提取，获得100g胰岛素需800－1000kg的牛胰脏。现在用基因工程方法在大肠杆菌中表达产生。人生长激素具有物种特异性，只能用人的生长激素来治疗侏儒症。以前从尸体脑垂体中提取，来源非常有限，现在用基因工程方法在大肠杆菌中表达产生。干扰素体外培养人体细胞来生产，产量低，成本高，现用重组大肠杆菌生产。2.动物植物的遗传改良不易腐烂的番茄兔毛棉花在我国培育成功：用兔的一种角蛋白转化棉花，棉花纤维质量好，具有兔毛般的光泽。转基因小鼠：导入人类基因，具有较强