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第三章超薄切片与半薄切片第一节超薄切片专用于透射电子显微镜标本的制备透射电镜•透射电镜是观察细胞及亚细胞结构的重要手段：我们所获得的关于细胞、细胞器、细胞内大分子的形态信息大多由它提供•透射电镜的样品制备中，超薄切片技术是最基本、最常用的制备技术。高尔基体Chloroplastoftobacco:1=cellwall2=cytoplasm3=vacuole4=chloroplastenvelope叶绿体被膜5=tonoplast液泡膜6=plasmamembrane质膜7=grana叶绿体基粒8=stromathylakoids类囊体9=starchgrains淀粉粒10=stroma基质叶绿体内质网线粒体酶体超薄切片植物细胞的大小直径多为25-50um之间。最小：球菌直径0.5um。最大：苎麻纤维细胞长550mm。超薄切片厚度是50-70nm1细胞=350-1000张切片•透射电镜样品制备中，由于透射电镜产生的电子束穿透能力很弱，必须把标本切成厚度小于0.1um以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片。•切片厚度:50-70nm•制作程序与石蜡切片相似,只是包埋剂不同(环氧树脂),切片方法不同超薄切片制作程序一.取材的基本要求为保持细胞结构的生前状态,必须做到快、小、准、冷(1)快:最短时间内(争取在1min内)投入固定液。(2)小:体积要小(一般不超过1mm×1mm×1mm)。固定剂的渗透能力较弱；如果块大，内部不能得到良好的固定。(3)准:取材部位要准确。(4)冷:低温(0℃～4℃)操作,以降低酶的活性,防止细胞自溶。与石蜡切片相似,经取材、固定、脱水、浸透、包埋聚合、切片及染色等步骤。二.固定1.固定剂四氧化锇:对多细胞结构蛋白,脂肪,脂蛋白的固定效果好。有强烈的电子染色作用,固定样品图象反差较好。戊二醛:穿透力比四氧化锇强.糖原、微管、核蛋白的固定效果比锇酸好.对脂类的保存能力很差,没有电子染色作用。电子染色原理某些重金属盐（铀、铅等）与组织细胞中某些成分结合或被组织吸附,重金属的原子对电子束形成散射,从而提高图象的反差。拟南介小孢子母细胞二.固定2.固定方法:戊二醛—锇酸双重固定法-分预固定和后固定,中间用磷酸缓冲液漂洗.-这样可以相互补充,使细胞的细微结构得到很好的保存。步骤:前固定用2.5%戊二醛固定2小时、后固定用1%锇酸固定1～2小时，脱水。缓冲液漂洗20min三.脱水常用脱水剂:乙醇、丙酮梯度脱水四.过渡环氧丙烷:相当于石蜡切片中的透明剂二甲苯。五.浸透和包埋(一)浸透利用包埋剂渗入到组织内部取代脱水剂。步骤:环氧树脂+无水乙醇(1:1)中12小时→环氧树脂24小时(二)包埋剂环氧树脂:高分子聚合物,单体状态时(聚合前)为液体、能够渗入组织内;当加入硬化剂和经加温后,聚合成固体包埋剂:环氧树脂硬化剂:酸酐类,与环氧树脂起交联作用,并被吸收到树脂链中十二烷基琥珀酸酐(DDSA),六甲酸酐(MNA),顺丁烯二酸酐加速剂:引起环氧树脂末端环氧基相连，形成首尾相接的长链状聚合物,加速包埋剂的凝固速度。2,4,6－三(二甲氨基甲基苯酚)(简称DMP(30)、二乙基苯胺及乙二胺增塑剂:使包埋块具有适当的韧性，改善包埋块的切割性能。邻苯二甲酸二丁酯(简称DBP)环氧树脂包埋剂的配方包埋步骤1.组织块包埋在环氧树脂包埋模板中，2.置烤箱烘干，3.经45℃(12小时)、60℃(36小时)后，即可聚合硬化，形成包埋块。包埋操作中注意事项(1)干燥:所有试剂要防潮,所用器皿应烘干；(2)搅拌:配包埋剂时，每加入一种试剂要搅拌均匀；(3)包埋时动作轻巧，防止产生气泡；(4)皮肤尽量不要接触包埋剂，以免引起皮炎；药用胶囊：最好用1号(直径6.3mm)或2号(直径5.6mm)包埋步骤:a.取载玻片硬纸盒作为支架，用打孔器在纸盒的盖上钻若干排孔，孔的直径比胶囊略小。b.然后将胶囊插入孔内，胶囊的底部悬空。c.打开胶囊盖子，用滴管将包埋剂加入胶囊内至3/4的位置，然后小心地将材料连同少许包埋混合液移入胶囊内，待材料下沉到胶囊底部后，用一只细的清洁铜丝调整材料的方位，盖上胶囊盖。d.但在加盖之前，必须把盖的圆顶端压凹，这样可以避免空气停留在盖的顶端，因为氧气会阻碍环氧树脂凝固。e.最后将载有胶囊的纸盒放进温箱中，按45℃12小时、60℃36小时的顺序升温聚合。参考:材料的包埋六.切片(一)准备工作1.修块:解剖显微镜下,削去表面的包埋剂,露出组织;2.半薄切片定位:切厚度为1μm-10μm的切片,染色,光学显微镜观察定位;3.修整:定位以后,对包埋块作进一步的修整。顶端金字塔形,顶面梯形,每边长度0.2mm～0.3mm。半薄切片进行光学显微镜观察的目的：(1)定位:确定所要观察的范围,保留观察的部分,修去其余部分;(2)对同一组织的同一部位进行光学显微镜和电镜的对比观察。4.制刀:玻璃刀，钻石刀-制刀机5．载网和支持膜5.1载网铜网，圆形、直径3mm。网孔数目100、200、300目等;5.2支持膜聚乙烯醇缩甲醛膜,载网上覆盖一层,厚度10nm～20nm。(二)切片(1)安装包埋块；(2)安装玻璃刀；(3)调节刀与组织块的距离；(4)调节水槽液面高度与灯光位置；(5)调节加热电流及切片速度；(6)切片。(三)展片当有皱缩的切片浮在槽液时,用一小块滤纸浸少量氯仿,接近切片,以这种蒸气熏之,使切片展开。(四)捞片将切片捞在有支持膜的载网上。直径3mm七.染色(电子染色)原理:重金属盐与组织细胞中某些成分结合或被组织吸附,电镜观察时重金属的原子对电子束形成散射,从而提高图象的反差。常用染色剂:醋酸铀和柠檬酸铅染色方法a.组织块染色:脱水至70%乙醇,组织块放在用70%乙醇配制的饱和醋酸铀溶液中,染色2h以上,或冰箱中过夜。b.切片染色:溶解石蜡制作蜡板,蜡板上滴数滴柠檬酸铅染液,载网浮在液滴上(贴有切片的一面朝下),盖上培养皿,染色10-20min.载网从染液中取出后,必须尽快用蒸馏水清洗干净.八.电镜观察、拍片、记录取材、固定、脱水、浸透、包埋聚合、切片及染色超薄切片技术步骤过程图第二节半薄切片半薄切片法•可供光学显微镜观察研究的塑料切片技术；•制片方法与超薄切片相同，但切片厚度约在0.5-2.0um，介于石蜡切片与超薄切片之间；•效果比石蜡切片好:较薄，能较好的保存细胞的结构，减少人为假象，比石蜡切片清晰。•常用包埋剂：乙二醇丙烯酸酯(GMA)与环氧树脂一、乙二醇丙烯酸酯(GMA)制片技术1.水溶性塑料包埋剂-凝固后可被切成0.5-2um的半薄切片2.染色时无须去包埋剂3.可在低温下凝固(紫外光照射)4.单体分子渗透性强,凝固时仅是把结构分子支撑和包围起来,并不与结构分子形成共价键5.清晰度高、保存结构完整性好6.可做组织化学、酶活性和荧光显微观察(一)GMA的性质GMA只有与增塑剂及加速剂混合才能用于制片增塑剂:控制包埋块硬度加速剂:加速包埋剂凝固，也可以控制硬度配方:GMA93g聚乙二醇400(增塑剂)7g过氧化苯酰(加速剂)0.6g(二)GMA包埋剂的配方1.固定常采用戊二醛和四氧化锇双重固定法固定方法与超薄切片一样2.清洗用0.1M磷酸缓冲液洗涤3-4次3.脱水梯度乙醇至100%4.渗透GMA包埋剂,0-4℃下两天以上，换两次。(三)GMA制片过程与超薄切片相似,经取材、固定、清洗、脱水、渗透、包埋聚合、切片及染色等步骤。5.聚合(包埋)用明胶胶囊做模具A.加热方法:40℃1-2天，60℃1天。一般观察。B.低温聚合:0℃下紫外光照射。做组织化学定位。6.切片普通切片机、超薄切片机7.展片切片捞起后放在滴有蒸馏水的载玻片上,在酒精灯上烘烫,待切片完全展开后,用吸管将水吸走,烘干切片8.染色不需要去掉包埋剂。常用甲苯胺蓝-O染色。7.苯胺蓝(anilineblue)特点:酸性染料，染纤维素细胞壁、非染色质结构二、环氧树脂半薄切片技术1.切片前处理与电子显微镜样品制备相同。2.切片、粘片与GMA制片方法类似3.染色一般石蜡切片的染料都可以用结晶紫，甲苯胺蓝-O经取材、固定、清洗、脱水、渗透、包埋聚合、切片及染色等步骤。三、GMA与环氧树脂半薄切片比较1.GMA的优点:可以做组织化学定位。缺点:不能进行电子显微镜观察2.环氧树脂的优点:在同一个结构上既可以得到光学显微镜的影像，又可以得到电子显微镜的影像。缺点:组织化学染色有一定难度。3.发展趋势:发展兼有两者优点的包埋剂(L.R.Whiteresin等)