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C.13生物聚集：流动鱼的测定1.方法这个生物聚集实验是OECDTG305（1996）的翻版1.1.引言这个方法描述了流动条件下鱼的生物聚集能力，虽然流动测定的变化特征是更好的，但是假如确实性标准满足的话，半静止的变化特征也是可以的。为了满足不同的实验环境和各种特征的测定物质，这个方法给了足够的细节以便于给予实验者足够的自由去改变实验设计。当LogOWP在1.5到6之间时，这种化学药剂是最好的。（1）但是极亲脂性的试剂也可以（LogOWP6）生物富积因子（BCF）有时用BK表示。对于这种极亲脂性的试剂我们测得的BK数值应该会比稳定状况下的生物富积因子（SSBCF）要大。预计我们用BINIEIN公式的话测得的生物富积因子的LogOWP值会有9.0那么大。影响生物聚集能的参数有吸收率常数（1K）、释放率常数（2K）和稳定状况下的生物富积因子SSBCF。用放射性物质标记可以使测量定量时更加方便。只要测出最终剩余的放射性物质（例如：氧化或组织增溶），BCF是由母体化合物、保留的代谢物和吸收的碳所决定的。BCF并不是完全依赖于放射性剩余，可以用获得的BCF与母体化合物进行比较组作为特别的化学分析。整理一下过程，我们用放射性标记测定BCF，母体化合物和主要的代谢物如果需要的话应该被标记。我们还可以分析和识别鱼组织中的残余物质，并进行生物聚集的研究去组成对鱼代谢物的研究。1.2.定义及单位生物聚集即实验物质在器官（特别在组织中）浓度的增加与物质在环境中的浓度有关。生物富积因子（BCF或BK）在这个聚集实验的吸收阶段的任何时候都是与测定物质在鱼或组织的周围浓度有关的。这个浓度是被周围的化学物质所分割的。稳定状态的生物富积因子（SSBCF或BK）在延长的时间里并没有明显的改变，在这段时间里，周围测定物质的浓度是恒定未变的。当鱼中的物质浓度（Cf）曲线开始平行于时间轴，这时达到了平台期或者叫做稳态。取三次样，每次至少相隔两天，Cf数值彼此相差在20%以内，并且鱼周围的环境没有什么明显的变化时，我们说鱼中的物质稳定和平衡了，当分析合并样本时，至少需要四个连续的分析。对于吸收慢的物质我们最好需要七天。可以直接从动力学比例常数（21KK）计算得出动力学富积因子（BFCk）。辛醇-水分配系数（Pow）是平衡时正辛醇在水中的溶解比率。水生生物体的生物聚集潜力用Pow的对数来标记。吸收阶段是鱼在暴露在测定物质中的时间。吸收率常数（K1）是鱼暴露于测定物质中时鱼中的测定物质的浓度的增长速率的数字表达（单位：天-1）。释放阶段是将鱼从含有测定物质的环境中转移至不含测定物质的环境中后，对外释放测定物质的阶段。释放率常数（K2）是将鱼从含有测定物质的环境中转移至不含测定物质的环境中后鱼中的测定物质的浓度的减小速率的数字表达（单位：天-1）。1.3.原理和实验方法实验分为两个阶段：聚集阶段和释放阶段。在聚集阶段过程中，分开的各组同类鱼放在至少两种浓度的测定物质中，然后把它们转移到一个没有测定物质的环境中去进行释放阶段。只要聚集阶段中在生物体内的测定物质的聚集是比较明显的（BCF10），那么就需要进行释放阶段。在两个阶段时生物体内的测定物质都要进行测量。除了两种实验浓度，我们还要有一组鱼放在一个没有测定物质但其他条件都和两组实验组相同的环境下，用来作为“背景”。在没有证明平衡早已达到前聚集阶段需要进行28天，附录3的公式可以推导出聚集阶段至少需要的天数。将鱼转移到另一个没有测定物质但其他环境相同的容器里释放阶段就开始了。生物富积因子可以用两种方法计算，一种是周围测定物质的浓度与生物体内测定物质的比值；或者水中浓度与动力学生物富积因子的比值。KBFC=21KK，是满足动力学第一定律的。如果明显不符从动力学第一定律，那么我们就要用更加复杂的模型了（附录5）。如果28天都没有达到平衡，那么聚集阶段就应该延长，如果直到60天也没有达到平衡，那么就中止聚集阶段，而进入释放阶段。聚集率常数、释放率常数、生物聚集因子都可以从一个把鱼和水中的测定物质浓度描述的很好的模型中计算出来。BCF可以用鱼的总湿重的一个函数表示。另外，当有特殊目的时，我们还可以把鱼分成肉和内脏两部分。对于许多有机物质，生物聚集能和和亲脂性有着明显的关系，测定物质的生物聚集和鱼的脂肪体积也有着一致的关系。为了减少实验结果中变量的影响，我们使用高脂性的（LogOWP3）物质，生物聚集就和鱼的总重和脂肪体积有关。条件允许的话，我们应该用相同的生物材料和脂肪体积来决定测定物质的浓度。1.4.测定物质及性质在测定生物聚集能前，我们应该了解测定物质下面的一些信息：水中的溶解度；辛醇-水分配系数（OWP）；水解作用；水中的折射率；表面张力；还有以下信息需要知道：实验中测定物质对鱼种的毒性强度，最好是渐进的LC50。一个合适的分析方法，要准确且精确，用于对实验实验结果和生物材料中测定物质定量化，对样品的细节进行准备。还要知道水和鱼中的测定物质的最小探测限度。当用14C进行标记时，应该要知道放射性物质的百分比与杂质的关联。1.5.实验的注意事项为了保证实验正确有效地进行，以下几个方面要注意：温度的变化要小于2℃；水中溶解氧的浓度不能低于饱和浓度的60%；在聚集阶段容器中测定物质浓度的测量值应该保持在上下20%；实验结束时鱼的死亡率要低于10%；当实验延长几周或几个月时，每组鱼的每月死亡率不能超过5%，总死亡率不能超过30%。1.6.参考物质我们可以用已知生物聚集能的参考物质检测实验进程。这里不推荐特别的化合物。1.7.实验方法描述1.7.1.仪器我们要避免使用任何部分会被溶解、吸收，或对鱼有不利作用的仪器。我们可以用矩形或圆柱形的用化学惰性材料制得的仪器，要有一定的容积和装载率。软塑料管的使用要减小到最小。可以用聚四氟乙烯（TefLon）、不锈钢或玻璃管。经验证明：可以使用有高吸附系数的材料，如硅化玻璃。在这种情况下仪器才不会在实验结束后就被丢掉。1.7.2.水在实验中使用的天然水必须是无污染且取自相同的来源的水。稀释的水必须要使被选用进行实验的鱼存活并且不出现不正常的现象和行为。应该来说，我们要先验证鱼在这种水中可以生存、生长、繁殖。这种水有适当的pH、硬度、总固体、总有机含碳量、最好还有氨基盐、亚硝酸盐、碱度，对于海种鱼，还要有含盐量。如果很好的了解了这些参数是最好的，附录1推荐了海水和淡水这些参数的最高浓度。在实验的过程中水应该有恒定的性质。pH值应该在6.0到8.5之间，但是给定条件的实验中应该变化在上下0.5pH之内。为了保证稀释水不会不恰当的影响实验实验结果，或者对参照的鱼有不利的影响，样品应该被隔离分析。要测定重金属含量（铜、铅、锌、汞）主要的阳离子和阴离子（Ca、Mg、Na、K、CL、SO4），农药（总的有机含磷量和总的有机含氯量）总的有机含碳量和悬浮固体。水的相对质量每三个月要测量一次，如果水的质量在一年内保持不变，检测的频率和时间就可以适当放宽（六个月一次）。水的自然粒子常数总的有机含碳量应该越小越好，防止测定物质在有机物质上的吸附而降低它的生物有效性，最大值可允许为5mg/L。对于特殊的材料（干物质直径最小要大于0.45μm）总的有机含碳量要小于2mg/L。如果需要，水在使用前还应该先过滤。鱼和食物残渣造成的水中有机碳含量应该减小到越小越好。整个实验过程中容器中水中有机含碳量不要超过实验开始时测定物质的有机碳含量，如果超过，可以用溶解药剂。1.7.3.实验溶剂先制得适当测定物质浓度的实验溶剂。实验溶剂应该只是将稀释水和测定物质搅动混合。不推荐用溶剂或分散剂；虽然有时它会产生合适的浓度。溶剂可以用乙醇、甲醇、甘油、乙二醇单甲基醚、乙二醇二甲基醚和N，N-二甲基甲酰胺。分散剂可以使用CrmopHorRH40，Tween80，甲基纤维素0.01%和HCO-40。使用这些药剂时要注意它们可能会使实验时细菌繁殖造成实验上的问题。测定物质应该用放射性标记，且应用最高的纯度（纯度98%）在实验中应有一个持续分配和稀释测定物质的储存溶液。每天每个测试通道至少改变5次量。应该选择流动的模式，但确定性标准满足的话半静止模式也是可以的。每天的前后48小时应对储存溶剂和稀释水进行测定，实验结果相差应该保持在20%以内。1.7.4.种类的选择鱼的种类应该满足（1）易获得的；（2）大小合适；（3）可以满意地保存在实验室。其他标准还有：可以有观赏性的、有商业用途的、符合生态的、有较好的反应能力的、以及以前有过成功用途的等。附录2给出了推荐的鱼种。其他种类的鱼要是在实验中使用就要有适应的环境。鱼的选择应该参照实验方法。1.7.5.鱼的保存在实验过程中用足够的食物和一样的环境以及实验的温度使储存的鱼适应实验的环境。在48小时的安排时间里，记录下死亡率，以及满足以下的标准：一周内鱼的死亡率高于10%：抛弃全部的一组；一周内鱼的死亡率在5%到10%之间：让这组鱼多适应7天；一周内鱼的死亡率低于5%：接受这一组，但如果在接下来的7天内鱼的死亡率高于5%抛弃全部的一组。保证实验中使用的鱼没有可见的疾病或不正常的现象。抛弃有疾病的鱼。在实验过程中或实验前两周内不要对鱼进行治疗。1.8.实验过程1.8.1.预备实验进行一个预备实验去完善决定性实验的实验条件是很有好处的，比如，选择测定物质的浓度，聚集阶段和释放阶段的持续时间。1.8.2.放入的条件1.8.2.1.聚集阶段.实践的经验可以预测聚集阶段的持续时间（如从先前的实验中），或者利用含水的溶解度或者辛醇-水分配系数。（附录3）在没有证明平衡早已达到前聚集阶段需要进行28天。如果到了28天平衡还没有达到，就将聚集阶段延长，再进行进一步的测量，直到达到平衡或60天。1.8.2.2.释放阶段释放阶段持续一半时的时间对测定物质在身体中由于氧化作用而减少一般是合适的（比如95%）（附录3对估计进行解释）。当达到95%释放量需要的时间是不切实际的长时，超过比如聚集阶段的两倍（超过56天）我们可以用少一点的时间（直到测定物质少于平衡时的10%）。然而有些物质对于比“单间”鱼模型有着更加复杂的聚集和释放模式的物质，不能象模型那样产生一阶动力学常数，需要用更长的释放阶段来确定损失速率常数。这个时期鱼体内的测试物质浓度高于分析方法的检出限，释放阶段的时间受该浓度的控制。1.8.2.3.测定鱼的数目每次采样每个浓度的样品至少要有4条鱼。如果要更有力的统计实验结果，就需要更多的鱼。如果用成年的鱼，必须记录它们的雌雄、或者都在实验中使用。如果都在实验中使用，那么在聚集阶段之前就必须把不同性别的鱼的脂肪体积记录下来；把雌鱼和雄鱼一起实验是必要的。在任意一个实验中，应选用体重相似的鱼进行实验，最小的鱼不能小于最大的鱼的2/3。因为鱼的体重和年龄对BCF有很大的影响（1），所以所有的鱼应该是相同年龄的，并且是有相同的来源的。这些细节应该被准确记录下来。我们推荐在实验前将半样品鱼称重以便于对实验中鱼的体重对实验的影响进行评估。1.8.2.4.装载鱼的密度应该尽量大，以减少实验开始时CW对鱼的影响和避免溶解氧的浓度的下降。装载率对实验鱼种要是合适的，这一点非常重要。在任何情况下，每天每公升装载0.1-1.0克的鱼的装载率是不错的。如果测定物质的浓度可以保持在上下20%，并且溶解氧的浓度不低于饱和时的60%，那么装载率是可以的。在选择合适的装载容器时，应该依据不同生活环境的鱼进行选择。比如生活在水面的鱼比生活在深海的鱼需要有更大的顶部的鱼缸。1.8.2.5.饲养在适应和实验阶段，合适的鱼食应该有以下特征：要知道蛋白质和脂肪的总含量，要让鱼能保持一个健康状况和保持体重。实验过程中鱼每天要喂食量大约是体重的1-2%；这样才能保证鱼的脂肪含量在整个实验过程中保持恒定。喂食的总数应该被重复计算，比如每周一次以保证鱼的脂肪含量在整个实验过程中保持恒定。计算时，每个容器中鱼的体重都应该把鱼取出计算，不要在容器中称重。在喂完食后一段时间（0.5-1小时）就应该对容器里的未吃完的食物和排泄物进行清扫。容器中应保持清洁使得有机碳含