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B.12.诱变(性)－体外哺乳动物红血球测定1.方法这一个方法是经济合作暨发展组织TG474的哺乳动物红血球微核测定复制(1997).1.1.引言哺乳动物体内微核测定用来发现对测定成分感应的染色体有核红细胞的有丝分裂的物种如骨髓所抽取样品的红血球和/或外围设备动物的血球通常是啮齿动物。微核测定的目的要识别造成细胞生成的损害的物质是哪一部分造成的。微核的形成包含滞后的染色体碎片或整个的染色体。当骨髓有核红细胞进入一个多色的红血内发展的时候,主要部份被挤出;任何的微核已经被形成可能留在后面以别的方式收集细胞质微核在这些细胞中被促进因为它们缺乏一个主要的核心。微核的频率增加的动物多色的红血球感应染色体的损害。老鼠的骨髓自多色的红血球以后通常被用于这一个测定。不成熟的微核的测量(多色的)周边的血红血球相等地是可接受的在任何的物种方面在无能要除去微核红血球的脾脏已经被示范,或已经显示一个合适的急性因素结构的或数字的染色体变异。微核可能被许多的标准区别。包括着丝点或微核中的着丝点DNA的出现确认或缺少。微核的频率不成熟的(多色的)红血球是那主要的端点。外围设备的成熟(正常染色质的)红血球的数字也包含在成熟的红血球的一个给定的数字之中的微核的血可能被用如测定的端点，当动物不断地被对待达4个星期之久的时候或更多。体内微核测定的这一个哺乳动物尤其是与估定有关导致有机体突变的物质它允许考虑活体新陈代谢的因素，药物动力学的危险和DNA-修理处理虽然这些可能在物种之中改变遗传基因的端点。在活体测定中进一步的调查是也有用的。在体外系统中一导致有机体突变的物质被发现。如果有证据测定物质,或一个没有活性的新陈代谢产物,将不达到目标,使用这一个测定是不合适的。一般引言在部份B。1.2.定义着丝点(Kinetochore):是染色体上的一个区域，是细胞分裂时纺锤体连接的地方，从而允许姊妹染色单体有序的运动到子细胞中。微核:小的核,分开和附加到细胞的主要核,在有丝分裂末期有染色单体或整个染色体形成。正常染色质的红血球:成熟的红血球缺乏核糖体并且能够通过核糖体染色和未成熟的正常的红细胞区分开来。多染性红细胞:不成熟的红细胞,是红细胞形成中的一种状态，仍然含有核糖体因此可以和成熟的红细胞区分开来。1.3.测定方法的原理动物藉着一条合适的路径接受测定物质。如果骨髓被用,那动物在测试合适的时侯被宰杀,吸取骨髓,和准备制备和染色（1）(2)(3)(4)(5)(6)。(7)当peripheralblood被用的时候,血在测试开始后合适的时侯被收集并且准备被做而且标记(4)(8)(9).(10)因为用withperipheralblood研究,在最后一次接触药品和细胞收集中间尽可能短的时间内收集血液。分析配制品验证微核的存在。1.4.测定方法的描述1.4.1.准备1.4.1.1.动物物种的选择如果使用骨髓，推荐使用小鼠或大鼠的,虽然任何的适当哺乳动物物种可能被用。当体外进行血液测试时，推荐使用小鼠。然而,任何的合适的哺乳动物的物种可能被用。但是一个物种作为提供一脾脏不除去微核红血球或一个已经显示合适的急性物种发现引起染色体在结构或数目上发生变异。实验室通常使用的年轻健康动物的可以被使用。在研究中,各性别动物的重量变化应该是最小的并且不超过_20%。1.4.1.2.居住和饲养情况常用条件参考总引言B尽管目标,湿度应该是50-60%。1.4.1.3.动物的准备健康的年轻成年的动物随机地被指定为对照组和测试组。实验动物进行了个体的确认。动物适应实验室的新环境至少为五天。应该采取特殊的方法使关进笼内动物产生的影响尽可能被减少。1.4.1.4.试剂的准备固体测定物质应该在合适的溶剂或介质中被溶解或稀释,如果合适的,在选配动物之前。液体测定物质需被直接配制或在稀释之后配。测定物质需及时准备，除非数据的稳定性可以显示储存的可行性。1.4.2.测试条件1.4.2.1.溶剂/介质溶剂/介质在剂量水平下不应该产生毒性作用,而且不应该是和测定物质起化学反应。如果除了众所周知的溶剂/介质被用,它们应该由数据支持它们的兼容性。如果被推荐无论那里都可以,这样的溶剂/介质首先应该被考虑。1.4.2.2.对照组条件同时进行的阳性的和阴性(溶剂/介质)的对照组应该在每个测定中包括每种性别。除了处理测定物质，对照组的动物应该是以同一的方式处理。阳性的对照组应该被选用一边有清晰的作用但是并不一定可以立即向读者展现密码的特征。以一条不同的路径管理对照组阳性的结果并且只进行单一的取样是可接受地。当可得的时候化学的班级使用相关阳性的对照组化学药品应被考虑到。包括物质的阳性对照组的例子:物质cas号码EINECS号码甲磺酸乙酯62-50-0200-536-7乙基亚硝基脲759-73-9212-072-2丝裂霉素C50-07-7200-008-6环磷酰胺一水环磷酰胺50-18-06055-19-2200-015-4替姆51-18-3200-083-5溶剂或介质单独处理的阴性的对照组,应该在每个取样的时候被用到，除非在组里被相同的方式处理过。从历史的对照组数据动物易变和频率是可得的。如果单一抽取样品被申请阴性的对照组,大部分合适的时间是第一抽取样品时间。除此之外，除非有历史的或出版了对照组数据示范在藉着被选择的溶剂/介质感应，没有有害的或诱导有机体突变的物质作用，未经处理的对照组也应该被用。如果血被用的外围设备,前治疗样品也可能是可接受如一个并发事件阴性对照组,当产生的数据为历史的对照组是在预期的范围中，只有在短周边的血研究中(例如,1-3治疗(s))可用。1.5.实验步骤1.5.1.动物的数量和性别每个测试和对照组必需至少包括每性别5只动物。如果研究的时间是从相同的物种研究得到的数据而且使用相同的标准的测试，在毒性中和性别上没有实质上的不同，然后在单一性别方面尝试将是允许的。人类对化学药品接触的可能是有性别差异的。例如一些药物制剂，就需要选用适当性别的动物进行测试。1.5.2.治疗时间表没有标准的测试程序(也就是1,2或较多的测试在24个h间隔内)可推荐。只要实在作用为这一项研究已经被示范或为一项阴性的研究，来自广大的剂量样品摄生是可接受的,像毒性一样的常被示范，否则界限剂量已经被使用,而且配制继续的直到抽取样品。测定物质也可能被提供如一份分散的剂量,也就是,二次治疗被只达几个小时分开,促进管理大体积材料。测试可用如下两种方法进行:(一)动物与测定物质一次一起对待。骨髓的样品被拿至少两次,开始必治疗后24个小时,但是使用抽取样品比早过24个小时的治疗被证明之后，不扩充超过治疗后48个小时以在样品之间的适当间隔。样品周边的血至少被抽两次,开始在治疗过程中不早于36个小时,藉由在第一个样品之后的适当间隔,但是不扩充超过72个小时。当一个阳性的回应在一点钟被辨认出抽取样品时间的时候,附加的抽取样品不被需要。(二)如果2或更多的日常测试被进行(例如二次或较多的测试在24个小时间隔内),样品在18和24小时之间应该是收集一次，在那之后最后的治疗为骨髓和一次在36和48小时之后为外围设备血的最后测试.(12)当有关的时候，其他的抽取样品可被用于附加。需要的时候可能应用其他有关取样时间。1.5.3.剂量水平如果是因为没有合适的数据而进行判定测定,，应该是在相同的实验室中,使用相同的种类，种属，性别和测试程序。(13)如果测毒性,三个剂量水平作为第一抽取样品时间。这些剂量标准的范围从最大到很小或甚至没有毒性。在比较迟的只有抽取样品时间最高的剂量需要到被用到。最高的剂量是定义如被产生毒性的告示剂量以致于比较高度的剂量甚至致命。具有生物学活性的特殊物质在低毒或无毒的剂量(如此的如荷尔蒙和细胞分裂素)可能是这些剂量中的一些例外。我们应该设定一个标准，而且应该在个案基础上来评估。最高剂量也可定义为一份剂量生产品骨头髓的毒性指示(例如，骨头的骨髓和周围血液中的不成熟的红血球在总红血球之中比例的减少)。1.5.4.极限测定如果一个测定以至少2000毫克/公斤身体重量的剂量水平作测试,或是当作在同一天中的两个疗程。没有观察得出的毒性作用的生产品,而且如果毒性物质不是预期的基于相关数据的物质,那么，三个剂量水平的完全测定就是没有必要的了。因为经过较长时间的研究,那界限剂量是达到14天的治疗2000毫克/公斤/身体重量/日子，1000毫克/公斤/身体重量/日子治疗时间要超过14天。估计人类要接触出在极限测定中会使用较高的剂量标准。1.5.5.剂量的管理测定物质通常用填喂法提供使用胃管或一合适的插管套管或腹膜内的注射。其他的显而易见的途径如果是正确的也是可以接受的。被测液体一次能注入的最大的体积主要仰赖测定动物的大小。最大体积不应该超过2毫升/100g/身体重量。比这些更大的体积的使用必须被证明。除了正常状态时，高浓度集中是具有加速破坏性质的刺激性的或腐蚀性的物质，易变的测定体积应该调整，使其集中以确保在所有的剂量水平是一个确定的常数。1.5.6.骨髓/血的准备骨髓细胞通常从下列各项屠宰品中的大腿骨或胫骨中获得。一般而言，从大腿骨或胫骨中得到的细胞，准备而且沾染使用确定的方法。外围血从在后面的静脉血管或其他的合适的脉管获得。DNA特殊技术[比如，吖啶橙（14）或Hoechst33258多pyronin-Y(15)]能除去一些与使用有关的人工品的非DNA特性污染。这一优势不预先排除传统的污染使用(例如,Giemsa).一些附加的系统，这些系统已经被确定为能充分的为实验室工作的微核[例如纤维素除去有核的细胞(16)]能也被用。1.5.7.分析不成熟红细胞在总红细胞中所占的比例,对每只动物来说,至少应该数200个骨髓红细胞和1000为周边的红细胞(17)来决定.所有的玻片(包括有阳性的和阴性的样品)都应该在用显微镜分析之前分别编码。不成熟的微核红细胞由每个动物至少有2000不成熟的红细胞来刻划。将成熟的红细胞视为微核可以获得额外的信息.当分析玻片的时候,在总红细胞中,不成熟的红细胞所占比例不应该比总样品数的20%少。当动物在4个或更多的星期中不断地被施以疗法时,每个动物至少有2000个成熟的红细胞也可以来刻划微核。如果经过充分证明和认证。自动化分析的系统(图像分析和细胞中止流程cytometry)是可以接受的人工评估的变通办法.2.数据2.1.结果的处理每个动物数据都应该以表格的形式呈交。实验的基本单元是动物。被刻划的不成熟的红细胞的数目,不成熟的微核红细胞的数目,和不成熟的红细胞在总红细胞中的数目都应该被分别列出,以有利于每只动物的分析。当动物4个星期或更长的时间内被不断地施以疗法的时候,如果成熟红细胞的数据被收集了,它也应该给出。每只动物的不成熟的红细胞在总红细胞中的比例和微核红细胞的百分比(如果可用的话)也应该给出。如果没有不同性别有不同反应的迹象，来自两性别的数据可以合起来进行统计分析。2.2.实验结果评价与分析有几个评定阳性结果方法,比如有一个与用药相关的微核细胞的数目的增加或在单一抽样时,在一个单一用药组中,微核细胞的显著增加。结果的生物学相关性应该首先被考虑。在评估测定结果时统计的方法可以被辅助使用(18).(19)统计的重要性不应该是阳性响应的唯一决定因素。意义不明确的结果应该在对实验环境改进后进一步的测定中澄清.结果不符合上述的标准的测定物质被认为是在这一个测定没有致突变作用.虽然最大多数的实验将清楚给出肯定或否定的结果,在少数情况下数据将会过程标题有关测定物质的活动明确判断。不管实验重复多少次,结果可能保持意义不明确的或可疑。由微核测定的阳性结果可以推出,物质引起有核红血球的微核染色体的损害或有丝分裂的损害是一种负面的作用。否定的结果表明，在这种测定条件之下，那测定物质不生产不成熟的红细胞的微核。测定物质或它的新陈代谢产物达成一般的循环或明确地目标薄的纱织品(例如，系统的毒性)的可能性也应该讨论。3.实验结果报告测定结果报告测定结果报告应该包括下列各项实验数据:溶剂/媒介物:-选择这种媒介物的理由，-在溶剂/媒介物中测定物质的