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发酵工程在制药工作中的应用研究进展发酵工程主要指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术。微生物发酵技术的产生•1857年法国化学家、微生物学家巴斯德提出了著名的发酵理论：“一切发酵过程都是微生物作用的结果。”•巴斯德认为，酿酒是发酵，是微生物在起作用；酒变质也是发酵，是另一类微生物在作祟。•同时，也可以把发酵的微生物分离出来，通过人工培育，根据不同的要求去诱发各种类型的发酵，获得所需的发酵产品。发酵的定义•1.传统发酵•2.生化和生理学意义的发酵•3.工业上的发酵1.传统发酵•最初发酵是用来描述酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡的现象，或者是指酒的生产过程2.生化和生理学意义的发酵指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，或者严格的说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。3.工业上的发酵泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程包括：1.厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸等。2.通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等发酵的流程空气空气净化处理保藏菌种斜面活化扩大培养种子罐主发酵产物分离纯化成品氮源、碳源、无机盐等营养物质灭菌微生物发酵制药坑生素的发现1928年，英国细菌学家FlemingB发现坑菌物质青霉素。在20世纪40年代，一共发现了14种坑生素，50年代发现了20余种，开始了化学结构改造的合成和半合成坑生素的阶段。目前发现并分离到约有9000种坑生素，半合成坑生素约1000种，但实际生产和应用的只有100余种。发酵制药种类微生物菌体发酵、微生物酶的发酵、微生物代谢产物、发酵微生物转化发酵。制药微生物的种类生产药物的天然微生物主要包括细菌、放线菌和丝状真菌三大类。细菌主要生产环状或链状多肽类坑生素，如芽孢杆菌（Bacillus)产生杆菌肽（bacitracin），细菌还可以产生氨基酸和维生素，如黄色短杆菌（Brevibacteriumflarum）产生氨基酸，大小菌生产维生素C。放线菌主要产生各类坑生素，以链霉菌属最多。生产的坑生素主要有氨基糖苷类、四环类、放线菌素类、大环内酯类和多烯大环内酯类。真菌的曲菌属产生桔霉素，青霉素菌属产生青霉素和灰黄霉素等，头孢菌属产生头孢霉素等。发酵制药的基本过程发酵制药就是利用制药微生物，通过发酵培养，在一定的条件下，生长繁殖，同时在代谢过程中产生药物，然后从发酵液中提取分离、纯化精制、获得药品。菌株选育（mutationandselectionbreeding）、发酵（fermentation）和提炼（isolationandpurification）是发酵制药的三个主要过程。工艺过程包括发酵和分离纯化两个阶段。发酵阶段包括生产菌、孢子的制备、种子制备、发酵培养，是生物加工工程过程。分离纯化阶段包括发酵液的处理与过滤、分离提纯、精制、成品检测、包装、出厂检验是化学分离工程过程。新药生产菌的选育自然分离：样品的采集与处理分离方法有稀释法和滤膜法活性测定非致病菌为对象，采用琼脂扩散法测定活性，筛选生物活性物质。可以使用耐药和超敏菌种。用HPLC、LC-MS等，分析鉴定活性物质。其他现代的筛选技术如靶向筛选、高通量筛选、高内涵筛选等可以结合使用。新药生产菌的选育自然选育：在生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程叫自然选育或自然分离。基本过程如下：菌种→单孢子或单细胞悬液→适当稀释→琼脂平板分离→挑单个菌落进行生产能力的测定→选出优良菌株。自然选育简单易行，可达到纯化菌种、防止退化、稳定生产水平和提高产量的目的。但效率低，增产幅度不会很大。新药生产菌的选育诱变育种：诱变育种是认为创造的条件，使菌种发生变异，从中筛选优良个体，淘汰劣质个体，是当前菌种选育的一种主要方法。其特点是速度快、收效大、方法相对简单。但缺乏定向性，要配合大规模的筛选工作。诱发突变的因素有物理、化学和生物三类。诱变育种的设计方案诱变育种整个过程涉及诱变和筛选两个阶段，甚至是不断多轮重复。新药生产菌的选育杂交育种：是两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选具有新性状的菌株。带有定向育种的性质。基因工程技术育种：采用基因工程技术即基因克隆与表达技术，过量表达或抑制表达某一个或一组基因，调控代谢过程，实现目标产物的高效表达。新药生产菌的保藏目的:保持长期存活、不退化、不丧失生产能力。保藏原理：使其代谢处于不活跃状态，即生长繁殖受抑制的休眠状态，可保持原有特性，延长生命时限。保存方法：斜面低温保存、液体石蜡密封保藏、沙土管保藏、冷冻干燥保藏、液氮低温保藏。保存机构：中国典型培养保藏中心（武汉大学）中国科学院典型培养物保藏委员会美国典型菌种保藏中心（AmericanTypeCultureCollection）英国国家菌种保藏中心（TheUnitedKingdomNationalCultureCollection）微生物培养基－－发酵培养基配制一般原则（1）生物学原则：根据不同微生物的营养和反应需要，设计培养基。各种成分之间的比例恰当，特别是有机氮和无机氮源，C/N比。一定条件下，各种原材料之间不能产生化学反应。具有适宜的PH和渗透压。（2）工艺原则：不影响通气和搅拌，又不影响产物的分离精制和废物处理，过程容易控制。（3）低成本原则：原材料要因地制宜，来源方便丰富，质量稳定，优质价廉，成本低。（4）高效性原则：生产安全，环境保护，质量高，最高得率，最小副产物。微生物培养基－－发酵培养基设计基本思路（1）根据他人的经验，初步确定培养基的成分，作为研究的起始培养基。（2）单因素实验：确定最适的培养基的成分。（3）多因素实验：进行各成分之间的浓度优化和最佳配比。如均匀设计、正交实验和响应面分析等统计学方法。（4）从摇瓶、小型发酵罐到中试，最后放大到生产罐。（5）综合考虑各种因素：产量、纯度、成本等后，确定一个适宜的生产配方。发酵过程的主要控制参数与检测物理参数：温度、压力、搅拌转速、搅拌功率、通气量、粘度、料液流量等。温度：保证酶的活性重要条件，不同的微生物菌种的最适生长温度和产物形成的最适温度都是不同的。化学参数：酸碱度、溶解氧浓度、氧化还原电位、产物浓度等。PH值：对微生物生长的影响很明显，发酵液的PH值的变化是菌体产酸和产碱的代谢反应的综合结果。溶解氧：是指溶解于培养液中的氧，常用绝对含量表示，也可用饱和氧浓度的百分数表示，用溶氧电极来检测。不同的菌种对溶解氧的需求是不同的，有一个适宜的范围。