第七章 外源化学物致突变作用

第七章外源化学物致突变作用概要•第一节概述—基本概念•第二节外源化学物致突变的类型•第三节外源化学物致突变作用机制及后果•第四节机体对致突变作用的影响•第五节观察化学毒物致突变作用的基本方法目的要求•掌握化学物致突变作用的基本概念、类型及后果。•熟悉评价化学物致突变作用的常用方法及使用范围。•了解影响化学物致突变作用的因素及评价致突变作用原则。第一节概述一、突变作用的研究史摩尔根（1866—1945），美国著名遗传学家，现代遗传学奠基人之一，提出了遗传学三条基本定律中的基因连锁互换定律，确立了基因作为遗传单位的基本概念，并因此而获得1933年诺贝尔生理学和医学奖。斯特蒂文特卡尔文·布里奇斯赫尔曼·约瑟夫·穆勒个性独特的三驾马车突变作用的研究史美国遗传学家。1911～1916年间，马勒是摩尔根果蝇小组的一个重要成员，他的主要工作是研究果蝇的遗传交换这是染色体遗传学说的重要基础，其内容已概括在果蝇小组成员合写的《孟德尔式遗传的机制》(1923)一书中。1927年，他发现了X射线的诱变作用。这项研究结果不但有助于研究基因的本质和基因如何控制代谢作用及个体发育，有利于通过突变基因进行染色体结构分析研究，而且在诱变育种发展农业生产方面也有重要意义。HermannJosephMuller(1890～1967)1946年获诺贝尔生理学医学奖。20世纪50年代，Watson和Crick阐明了DNA的结构，为研究突变机理开辟了一条新的途径。根据Franklin的新X光照片,Watson和Crick提出了双螺旋结构的设想,并将核糖核酸和磷酸组成的骨架放在分子的外面1962年获诺贝尔生理学医学奖。RosalindFranklin突变作用的研究史•1969年，Hollaender主持下在美国成立了环境诱变剂协会(Environmentalmutagensociety,EMS)。•遗传毒理学形成为独立学科。•国际癌症研究中心(IARC)证明人类癌症约有90%与化学物(包括药物)有关，并明确指出致癌剂中90%也是致突变剂。•Ames方法的建立和应用，在环境致突变物和致癌物的筛选方面取得了很大进展。二、基本概念•变异（Variation）生物体亲代与子代间或子代个体间不同程度的差异。产生原因：基因重组、基因突变、染色体成分改变、细胞质变化。•突变（Mutation）遗传物质自身发生改变及其引起的变异。分为自发突变和诱发突变•遗传毒理学(genetictoxicology)属毒理学下属三级学科,是研究化学性和放射性物质对机体遗传物质的损害作用（致突变作用）及可能引起的健康效应。•致突变作用(Mutagenesis)外来因素（化学物）引起细胞核中遗传物质发生改变的能力，且此种改变可随细胞分裂过程而传递。•遗传毒性(genetictoxicity)指对基因组的损害能力，包括对基因组的毒作用引起的致突变性及其他各种不同效应。•致突变性(Mutagenicity)是精确的概念，指引起遗传物质发生突变的能力，在一个实验群体中突变率可以定量检测。二者既有联系又有区别三、遗传学基础1.DNA与基因AgeneisdefinedbiochemicallyasasegmentofDNA(or,inafewcases,RNA)thatencodestheinformationrequiredtoproduceafunctionalbiologicalproduct.From.L.Nelson,M.M.Cox,LehningerPrinciplesofBiochemistry,2.染色质与染色体染色质：在间期细胞的细胞核中，由DNA、组蛋白及少量的RNA组成。染色体：在细胞分裂时，染色质螺旋化形成。思考：染色体与基因的关系？3.体细胞与生殖细胞体细胞：多是二倍体细胞，含有两组完全相同的染色体，其遗传损伤不会遗传给下一代。生殖细胞：是单倍体，其染色体改变及突变可传给下一代。4.基因型与表型5.细胞周期、有丝分裂与减数分裂第二节外源化学物致突变的类型遗传毒理学家主要关注三类遗传学损伤：基因突变，染色体畸变，染色体数目改变损伤多因DNA受损所致，也可能因DNA以外的靶组织受损。三类损伤的本质是相同的，区别在于受损程度。通常以光学显微镜的分辨率0.2μm来区分。一、基因突变（genemutation）基因中DNA序列的改变。也称为点突变（pointmutation）•分类按突变发生的原因：自发和诱发按基因结构改变类型：碱基置换和移码突变按突变的生物学意义：同义、错义、无义。•碱基置换(base—pairsubstitution)指某一碱基配对性能改变或脱落所致的突变。•转换(transition)嘌呤互相取代；嘧啶互相取代。•颠换(transversion)嘌呤取代嘧啶；嘧啶取代嘌呤。•对生物损害的后果取决于其在蛋白质合成过程中错义和无义密码的多少。同义突变•移码突变(frameshiftmutation)指发生一对或几对（3对除外）的碱基减少或增加，以致从受损点开始碱基序列完全改变，形成错误的密码，并转译成为不正常的氨基酸。•基因突变的特点：1是具有一定发生概率的偶发事件；2其发生率可受内外环境影响；3具有可逆性；4具有可遗传性。二、染色体畸变（chromosomeaberration）指染色体结构改变，它是指遗传物质大的改变。一般可用光学显微镜检查适当有丝分裂中期的染色体来发现。分染色单体型畸变和染色体型畸变。结构异常:缺失(deletion)重复(duplication)倒位(inversion)易位(translocation)染色体插入和重复示意图染色体缺失及环状染色体的形成图染色体的臂间倒位染色体相互易位示意图三、非整倍体和多倍体(aneuploidyandpolyloid)细胞的染色体数目不同于正常的染色体数目。或称为基因组突变（genomicmutation)即基因组中染色体数目的改变•染色体数目异常以二倍体细胞为标准进行命名。•非整倍体指增加或减少一条或几条染色体；•多倍体指以染色体组为单位的增加。人群出生发病率：1/700～1/900。如小头，枕部扁平，项厚，眼裂小，外侧上斜，内眦深，眼距宽，马鞍鼻，口常半开，舌常口外，手指短粗，掌纹有通贯，小指内弯等。50%合并先天性心脏病、消化道畸形、白血病等。自发按发生原因诱发转换点突变基因突变按结构改变颠换移码突变同义按生物学意义错义无义致突变作用缺失重复结构改变倒位：臂间、臂内异位：染色体畸变非整倍体数目异常多倍体第三节外源化学物致突变作用的机制与后果•直接作用于DNA诱导基因突变和染色体畸变•干扰有丝分裂诱导非整倍体和多倍体•非遗传物质损伤•(一)碱基损伤1.碱基错配2.平面大分子嵌入DNA链（9-氨基丫叮）3.碱基类似物的取代4.碱基的化学结构改变或破坏（亚硝酸盐使腺嘌呤和胞嘧啶发生氧化脱氨、甲醛）一、引起突变的DNA变化遗传物质损伤•（二）DNA链受损1.二聚体的形成当细胞或机体受到紫外线刺激。2.DNA加合物（DNAadducts）形成活性化学物与细胞大分子之间通过共价键活化癌基因，影响调节癌基因和抑癌基因的表达。3.DNA-蛋白质交联物(DNA-Proteincrosslink，DPC)形成是致突变物对生物大分子的一种重要的遗传损害。•与微管蛋白二聚体结合秋水仙碱可与该部位结合，产生细胞染色体不分离。•与微管蛋白巯基结合•已组装好的微管的破坏1）与微管结合蛋白结合2）非特异性地作用与微管，使其蛋白质变性3）使微管失去定向能力•中心粒移动受阻二、引起突变的细胞分裂过程的改变•DNA复制的高保真性与DNA复制相关酶类的损伤；•修复与DNA修复相关的酶受损。三、其他的改变四、突变的后果(一)生殖细胞突变•基因库（genepool）某物种在特定时期中能将遗传信息传递给下一代的处于生育年龄的群体所含基因总和。•遗传负荷（geneticload）是指在一种物种群体中每一个携带的可遗传给下一代的有害基因的平均水平。突变负荷：是指由于基因的致死突变或有害基因突变产生而降低了适合度，给群体带来的负荷。分离负荷：是指由于杂合子（Aa）和杂合子（Aa）之间的婚配，后代中必将分离而产生一部分适合度降低的纯合子（aa），因而导致群体的适合度降低。•后果有肿瘤、衰老、动脉粥样硬化及畸形等，最受关注的是肿瘤。•突变在癌发生过程中的中心作用的重要证据来自于癌基因和抑癌基因的分子生物学研究。(二)体细胞突变第四节机体对致突变作用的影响遗传物质在所有物种中能世代相传的原因：1）DNA执行高度保真的复制，对复制中的错误能及时纠正，即通过修复而达到高度保真；2）机体已进化有多种机制修复DNA损伤以保护亲代DNA链，使其免受化学毒物的作用而发生改变。机体修复DNA损伤的机制分为两大类：损伤耐受机制和修复机制一、DNA损伤的修复1.直接修复存在于多数生物体内，主要依赖酶作用。1）光复活（光裂合酶）2）“适应性”反应鸟嘌呤O-6位被烷化，易造成碱基错配。将鸟嘌呤O-6位甲基转给O-6甲基鸟嘌呤-DNA甲基化转移酶，鸟嘌呤恢复正常。2.切除修复负责较大范围损伤的修复机制，它是一个多步骤的修复过程。是一种比较普遍的修复机制。其过程是：切→补→切→缝由专一性核酸内切酶催化，在离损伤处附近切断；由DNA聚合酶在断口处进行DNA合成；由5′核酸外切酶将损伤部位切掉；由连接酶将新合成的DNA链与原来的链连接。切除修复有核苷酸切除修复和碱基切除修复两种。核苷酸切除修复碱基切除修复3.错配修复(mismatchrepair)它可以识别并除去错配的碱基对。4.双链断裂修复是一种耐受过程。5.交联修复1）无误交联修复2）易误交联修复化学致突变作用的模式损伤-〉修复-〉突变二、遗传因素对致突变作用的影响个体因素影响致突变作用有两个方面，一是先天性，即遗传因素；二是后天性，不同生活方式。(一)代谢酶遗传多态性遗传多态性(geneticpolymorphism)是一个衡量遗传变异的数据，即群体中多态基因的比例。1.氧化代谢酶细胞色素P450酶2.酯酶环氧化物水解酶3.谷胱甘肽硫转移酶(GST)(二)修复能力的个体差异修复酶的多态性1.O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶（MGMT）是体内一种特异性修复酶。MGMT多态性可解释某些个体对烷化剂作用特别敏感的现象。2.聚（二磷酸腺苷-核糖）多聚酶（PARP）是另一类参与DNA断裂的修复酶。PARP的激活为DNA损伤后细胞的早期反应之一。第五节观察外源化学物致突变作用的基本方法一、观察项目的选择•遗传学终点（geneticendpoint）：遗传学实验观察到的现象所反应的各种事件。•遗传学终点分类：共4类1）基因突变；2）染色体畸变；3）染色体组畸变；4）DNA损伤•遗传学实验配套原则：遗传学终点齐全；包括真核细胞和原核细胞；生殖细胞和体细胞俱在；体内实验和体外实验相结合，体外实验要有活化系统。•Definition:TheAmesTestisnamedafteritsdeveloper,microbiologistBruceAmes.•Itisatestthatmeasuresachemicalsmutagenicstrengthinabacterialcell.（一）细菌回复突变试验二、常见致突变试验基因工程致突变物常用的菌株有鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌（E.Coli)目前，Ames试验作为检测环境诱变剂的一组试验中的首选试验，广泛应用于致突变化学物的初筛。1组氨酸缺陷•原理：组氨酸缺陷型试验菌株本身不能合成组氨酸，只能在补充组氨酸的培养基上生长，而在缺乏组氨酸的培养基上，则不能生长。•鉴定方法：将测试菌株增菌液分别于含组氨酸培养基平板和无组氨酸平板上划线，于37℃下培养24h后观察结果。•结果判断：组氨酸缺陷型菌株在含组氨酸平板上生长，而在无组氨酸平板上则不能生长。2脂多糖屏障缺损•原理：具有深粗糙（rfa）的菌株，其表面一层脂多糖屏障缺损，因此一些大分子物质如结晶紫能穿透菌膜进入菌体，从而抑制其生长，而野生型菌株则不受其影