3细胞培养和离心技术2014.10

细胞培养和离心技术应用实例：诱导性多能干细胞（iPS）Cell.2006;126(4):663-76.Inductionofpluripotentstemcellsfrommouseembryonicandadultfibroblastculturesbydefinedfactors.TakahashiK,YamanakaS.DepartmentofStemCellBiology,InstituteforFrontierMedicalSciences,KyotoUniversity,Kyoto606-8507,Japan.ThesedatademonstratethatiPScellscanbeinducedfromMEFculturebytheintroductionoffourtranscriptionfactors,Oct3/4,Sox2,c-Myc,andKlf4.分化潜能（组织分化潜能（个体）研究的层次细胞组织动物培养的宫颈癌细胞扫描电镜培养的人骨肉瘤细胞细胞周期研究-U2OS细胞流式细胞技术免疫荧光技术细胞培养技术一.基本知识二.基本技术三.常见问题四.应用举例一、细胞培养的基本知识1.细胞培养的基本概念2.培养细胞的生存条件3.培养细胞的类型及其特点4.培养细胞的增殖过程√1.细胞培养(cellculture)从生物体内取出细胞或组织，在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下进行孵育培养，使之生存和生长，并维持其结构和功能的技术。*大量*遗传性状等条件相同的细胞；*可操控性；*动态、可观察性等体内、外细胞的差异体内细胞机体神经体液调节多种类型细胞相互影响基因表达受到外来信号调节增殖过程中不断发生着分化（由一般到特殊）高度特化的结构和功能特征：高度特化；体外细胞无神经体液调节无其他类型细胞影响细胞的许多外来信号被切断1.特定分化基因表达减弱或停止2.增殖活动维持（由特殊到一般）与体内细胞结构和功能的差异特征：失去原有形态;分化特性减弱特点对环境适应差；容易污染；对营养要求高；大部分需要附着载体生长；可能失去原有的形态功能特征。2.培养细胞的生存条件高要求的营养物质严格的环境条件营养物质•培养基(culturemedium)，合成培养基：提供基本的、与体内相同的小分子营养物质：葡萄糖、氨基酸、无机离子、维生素、微量元素。•血清（serum),天然培养基：提供多种生长因子等活性物质（大分子物质）。常用培养基：DMEM,RPMI1640,MEM,HAMF-10,HAMF-12,McCoy’s5A等注意营养物质的种类和浓度环境条件•温度35~37℃•气体95%空气/5%CO2•酸碱度pH7.2~7.4（酚红指示）•支持物玻璃、塑料、饲养层、微载体培养细胞浸浴于无菌培养液，生长在无菌的玻璃或塑料容器中，置于恒温、恒湿的二氧化碳孵育箱中。CO2孵育箱培养基培养容器严格无菌培养皿(dish)培养板(6-,24-,96-wellplate)支持物(Substrates)，培养容器(Vessels)培养瓶(flask)培养容器的容积、细胞数二氧化碳培养箱超净工作台（生物安全柜):无菌的保证成功的细胞培养：1.Well-established,properlyequipedcellculturefacility;2.Practiceofsteriletechniques;3.Appropriate,qualitycontrolledreagentsandsupplies;4.Theknowledgeandpracticeofthefundamentaltechniquesinvolvedinthegrowthofthecelltypeofinterest.1.贴附型(adhensivecell)贴附于支持物表面，单层生长；失去在体内原有形态，反映胚层起源情况；有接触抑制和密度依赖特征。大多数细胞属此型；2.悬浮型(suspensorycell)不贴附在支持物表面，以悬浮状态生长；，单个分散或成团。各种源自血液的细胞、骨髓、脾细胞。成纤维细胞型、上皮细胞型、游走型、多形型悬浮型3.培养细胞的类型及其特点MRC-5人肺成纤维细胞U-937细胞，人血液病细胞PC-3，人前列腺癌细胞A549，肺癌细胞体外培养的细胞株倒置显微镜体外培养的细胞,应注意：形态：贴壁、悬浮来源：人、鼠、其他分化程度：肿瘤细胞、正常细胞、胚胎干细胞4.培养细胞的增殖过程•细胞增殖细胞分裂形成子代细胞的过程。•增殖周期（细胞周期）：间期（G1-S-G2期）和分裂期（M期）群体中1.多数细胞处于间期，少数处于分裂期。2.间期较长，分裂期较短。HNSCCcellG1:56.42%S:14.85%G2:22.33%M:2.65%HeLacellMphase:20-40min;Interphase:around17hs培养细胞一代的增殖过程•传代(passage,subculture)：当细胞在培养容器中增殖到一定密度，生存空间及营养物质缺乏，需按一定比例分离，接种至新的培养容器并更新培养液，这个过程称为细胞传代。•一代:细胞接种后到下一次传代的一段时间；可增殖几次。•培养细胞一代的三个阶段：潜伏期、指数增生期、平台期实验研究多在指数增长期进行一定密度“汇片”接种平台期有活力，无增殖贴壁铺展体积变大、数目增多潜伏期有活力，无增殖传代指数增长期快速增殖，增殖几次012345（培养天数）细胞数量培养细胞一代的增殖过程培养细胞的生命期Lifespan:细胞在体外培养中持续增殖和存活的时间。一般可分为原代培养期、传代期和衰退期。1.原代培养：从体内取出细胞接种后到第一次传代。一般维持1－4周。2.传代期：原代细胞一经传代就成为细胞系（cellline），进入传代期。持续时间最长.一般传10－50代(Hayflick极限)。3.衰退期：细胞增殖缓慢、停止至死亡。肿瘤细胞：无限细胞系，永久增殖LifespanPhase衰退期培养细胞的整个生命期传代期，每代细胞的增殖时相一代Hayflick极限*体外培养细胞的增殖能力不是无限的，传代次数有一定的界限。*传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次；龟寿命200年，传代140次。*传代次数与个体年龄成反比：人胚胎，40-60代；幼年，20-40代；成年，10-30代；早老病儿童，2-10代。Hayflick极限提示的意义细胞不是不死的，细胞会由于内在的因素出现增殖衰退而衰老死亡。衰老机制的研究：“衰老钟”等增殖和衰老的秘密细胞培养四大要素1.Aseptictechniques；2.Facilities；3.Reagentsandsupplies；4.Cells.二、细胞培养的基本技术1、细胞分离和原代培养2、培养细胞的传代3、细胞计数4、细胞观察5、细胞的冻存、复苏和运输6、污染的检测和对策细胞培养的基本技术1、细胞分离和原代培养2、观察3、传代4、污染的检测和对策5、冻存、复苏6、计数常规维持实验前准备1.细胞分离•细胞悬液：离心收集•组织块：1.机械分散2.剪切分离3.消化分离胰蛋白酶法胶原酶法2.细胞传代（subculture)消化传代过程当细胞在培养容器中增殖到一定密度，生存空间及营养物质缺乏，需按一定比例分离，接种至新的培养容器并更新培养液，这个过程称为细胞传代。肿瘤细胞株的传代消化液的浓度和使用时间、细胞传代的频率和总的次数悬浮细胞的传代：离心或更新培养液贴壁细胞的传代：消化（0.25%胰酶+0.66mMEDTA)PassageNumberEffectsInCellLinesWhytheyhappenandwhatyoucandoaboutit?ATCCTechnicalBulletinno.7注意：肿瘤细胞的传代次数应用计数板或活力检测仪3.细胞计数（Counting)•细胞活力检测（0.4%trypanblue拒染）4.细胞观察(Observation)•培养液*颜色*透明度•细胞*生长概况*细胞形态变化•微生物污染5.细胞冻存（Cryopreservation)目的：1.保存细胞株2.保持尽量少的传代次数和较均一的细胞状态方法：低温保存法（Cryogenicstorage)：-130℃装置：液氮罐（liquidnitrogenfreezer）在不加保护条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水会形成结晶，影响细胞功能甚至死亡，冻存失败。*培养基中加入保护剂:甘油或二甲基亚砜（DMSO）；*缓慢地冻结；*贮存在－130℃以下低温。减少细胞内水分，减少细胞内冰晶形成低温保存原理LiquidphaseVaporphase细胞复苏(Thawing,Reconstitution)将冻存于液氮中的冻存管取出，迅速放入37～40℃水浴1min内融化，去除冻存保护液，更换正常培养基“慢冻速融”胞外结晶很快融化，减少水分渗入细胞6.细胞污染的防治•微生物（常见）：细菌、真菌、•化学物质：DMSO、EDTA等•细胞交叉污染污染的种类支原体微生物污染的途径•空气•器材•操作•血清•组织样本微生物污染对细胞的影响致死、增殖减慢、基因转录改变、功能改变微生物污染的检测培养基颜色、性状；细胞形态、功能；支原体的检测微生物污染的防治抗生素、加温等以预防为主，一旦感染较难救治三.常见问题•1.支原体污染•2.细胞认证（authentication)•3.遗传背景（genetic)1.支原体感染细胞救治抗生素：四环素大环内酯类喹诺酮类常用支原体感染救治Reputablecellsuppliers：1.AmericanTissueTypeCollection(ATCC)2.GermanCollectionofMicroorganismsandCellCulture(DSMZ)3.中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库（中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心）://细胞株来源：认证细胞的获得1.p53，Ras等癌基因、抑癌基因的状态：缺失、突变或野生；2.人种、年龄等3.病史等等，如病毒感染史3.遗传背景成功的细胞培养：1.Well-established,properlyequipedcellculturefacility;2.Practiceofsteriletechniques;3.Appropriate,qualitycontrolledreagentsandsupplies;4.Theknowledgeandpracticeofthefundamentaltechniquesinvolvedinthegrowthofthecelltypeofinterest.总结Highstandardsincellculture细胞培养和离心技术细胞结构成分分离的离心技术一.离心技术原理二.离心设备三.离心方法四.细胞结构成分的分离（略）Subcellularfractionation一.离心技术原理（Centrifuge)利用溶液中颗粒密度、大小等特性，用旋转产生的离心力使不同特性颗粒从溶液中分离并沉降，从而达到分离、浓缩、提纯和鉴定的目的，称为离心技术。*分离细胞或其他的悬浮颗粒，从混有多种细胞的悬液中分离某一细胞；*从组织或细胞匀浆中分离细胞器，包括细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体、过氧化物酶体、质膜、内质网等；*分离病毒和大分子，包括DNA、RNA、蛋白质和脂类。什么是离心力？匀速圆周运动的物体，在合外力消失或不足以维持向心力时，产生的背向旋转轴的运动力。3个因素：沉降系数相对离心力离心时间设备：离心机、离心介质溶液（细胞结构成分）：颗粒溶液、大小、密度特性1.沉降系数（S）：