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3，5—二硝基水杨酸法测定还原糖•掌握还原糖定量测定的原理和方法。•掌握分光光度计的使用。一、实验目的•还原糖的测定是糖的定量测定的基本方法。•还原糖是指含有自由醛基和酮基的糖类。•单糖均为还原性糖，双糖不一定是还原性糖，其中乳糖和麦芽糖为还原性糖，蔗糖和淀粉为非还原性糖。•利用糖的溶解度不同，可将样品中的单糖、双糖、多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定。再分别求出样品中还原糖和总糖的含量。二、实验原理•还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及产物，3，5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。•在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计在540nm波长下测定光密度值查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。二、实验原理（一）仪器小麦面粉、pH试纸、容量瓶、玻璃漏斗、移液管、量筒、试管、沸水浴锅（二）试剂（1）6mol/lHCl和6mol/lNaOH溶液（2）1mg/ml葡萄糖溶液准确称取80℃烘干恒重的分析纯葡萄糖0.1g，置于小烧杯中加入少量蒸馏水溶解后，移到100ml容量瓶中，用蒸馏水定溶至100ml，混匀，4℃冰箱中保存备用。三、试剂与仪器（3）3，5—二硝基水杨酸把6.3g3，5—二硝基水杨酸溶于262ml2mol/l的氢氧化钠中将此溶液与500ml含有182g酒石酸钾钠的热水混合，向该溶液中加入5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，充分搅拌溶解待溶液冷却后，用水稀释到1000ml，存储于棕色瓶中。三、试剂与仪器四、操作步骤（一）葡萄糖标准曲线的绘制1.按下表制备9个管2.向九支试管中分别加入0.5mlDNS试剂，充分混合。3.将九支试管放入沸水浴中加热煮沸5min。4.将试管放入盛有冷水的烧杯中冷却。5.向试管中分别加入4ml蒸馏水，充分混合。6.以空白试管试管作对照，于540nm波长下，分别测定各管OD值并记录。7.以每管的吸收值即OD值为纵坐标，相对应管的葡萄糖浓度为横坐标作图，得到一条直线，该直线通过零点。四、操作步骤（二）还原糖抽提液的制备1.称取2g小麦粉，把它放入一个100ml的烧杯中，然后加入50—60ml蒸馏水，搅拌均匀。2.把烧杯放入一个50℃水浴中保温30min。3.拿出烧杯，将烧杯内含物转入一个100ml容量瓶中，加水至刻度，充分混匀，过滤之，（滤出液用于测定还原糖）即得还原糖抽提液。四、操作步骤（三）样品的酸水解和总糖抽提液的制备1.把1g小麦粉溶于15ml水中并加入10ml6N的盐酸溶液混合。2.将烧杯放入沸水浴中加热煮沸30min后，冷却。3.加入6N的氢氧化钠中和烧杯内含物。4.将中和后的溶液转入一个100ml的容量瓶中，加水至刻度，充分混匀。5.将容量瓶中的溶液过滤。6.取1ml滤出液加水至10ml，即得总糖的抽提液。四、操作步骤（四）小麦样品中总糖和还原糖的测定1.取3支试管，编号分别为1-3，按下表向每支试管中加入试剂。2.将3支试管放入沸水浴中加热煮沸5min后，冷却。3.以空白试管（1号管）作对照，于540nm波长下，分别测定各管OD值并记录。四、操作步骤试剂管号123还原糖抽提液（ml）00.50总糖抽提液（ml）000.5DNS(ml)0.50.50.5水（ml）4.5441、葡萄糖的标准曲线五、计算y=0.0019x-0.0106R2=0.996700.20.40.60.811.21.41.602004006008001000浓度(ug/ml)吸光度五、计算从曲线中算出还原糖的浓度（mg/ml）xvx100还原糖%=-----------------------------------------------样品中mg数从曲线中算出总糖的浓度（mg/ml）xvx100x0.9总糖%=------------------------------------------------样品中mg数N:稀释倍数注：由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一个水分子，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。