实验四 叶绿素提取、理化性质及含量测定

设置对照的作用？[NO2-]处理-对照，[NO2-]B液-A液，准确分析NO3-对NR活性的诱导作用。B液中NO3-的作用？底物，而非诱导作用。存在问题：实验3硝酸盐和光诱导对硝酸还原酶（NR）活性的影响处理A液B液吸光度[NO2-]NR活性吸光度[NO2-]NR活性（uMol/ml）（uMol/h•gfw）（uMol/ml）（uMol/h•gfw）H2O0.0280.013(0.009)0.724(0.600)0.0640.026(0.020)1.705(1.333)KNO30.0420.018(0.014)1.179(0.933)0.2010.075(0.069)4.984(4.600)对照0.0050.0040.0100.006[NO2-]（uMol/ml）=0.0026＋0.359OD540NR活性（NO2-,uMol/h•gfw）=[NO2-]×10ml/1ml÷（鲜重g×0.5h）[NO2-]H2O=1.333-0.600=0.733[NO2-]KNO3=4.600-0.933=3.667实验四叶绿体色素的提取、理化性质与含量测定提取叶绿体色素分析叶绿素的物理、化学性质测定叶绿素的含量提取和测定植物组织中的光合色素是研究光合作用机理的重要技术手段。1.实验目的及意义2.1用含水的有机溶剂提取叶绿素2.实验原理亲水的“头部”：镁原子居于卟啉环的中央，带正电性，与其相联的氮原子则偏向于带负电性，因而卟啉具有极性，是亲水的，可以与蛋白质结合。亲脂的“尾巴”：叶绿醇是由四个异戊二烯单位组成的双萜，是一个亲脂的脂肪链，它决定了叶绿素的脂溶性。纯的有机溶剂不能打破叶绿体色素与蛋白质的联系，所以必须用能与水混溶的有机溶剂并有少量水存在时，才能将叶绿体色素提取出来。80%丙酮95%乙醇丙酮:乙醇:水(4.5:4.5:1)2.2叶绿素的物理性质1）叶绿素的吸收光谱红光区：640~660nm篮紫光区：430~450nm胡萝卜素和叶黄素：400~500nm不用蓝光区测叶绿素含量。2）荧光现象叶绿素溶液在透射光下呈绿色，而在反射光下呈红色的现象。2.3叶绿素的化学性质叶绿素是叶绿酸的酯（叶绿酸是双羧酸，其中一个羧基被甲醇酯化，另一个被叶绿醇酯化）。叶绿素可以与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，用此法可将叶绿素与类胡萝卜素分开。1）皂化反应皂化分层叶绿酸的盐形成以后，因分子极性增大，易溶于稀酒精溶液中，不能进入苯层；而类胡萝卜素在苯中的溶解度大于在醇溶液中；一部分苯分散在水中形成乳胶体，出现一层乳白色的溶液。低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出现白色絮状物，溶液浑浊，且不分层。2）取代反应卟啉环中的Mg处于不稳定的状态，可被H+、Cu2+、Zn2+等离子取代。稀酸：叶绿素溶液与稀酸作用，Mg可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，去镁叶绿素遇Cu2+则成为深绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏（常用醋酸铜处理来保存绿色植物标本）。浓酸：叶绿素溶液与浓酸作用，Mg被H+取代，且生成的去镁叶绿素迅速分解出叶绿醇，并形成去镁叶绿酸，呈褐绿色。1）吸收光谱红光区：640~660nm；篮紫光区：430~450nm。2）荧光现象叶绿素溶液在透射光下呈绿色，而在反射光下呈红色。3）皂化反应叶绿素是叶绿酸的酯，可与碱起皂化反应而生成醇和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，用此法可将叶绿素与类胡萝卜素分开。4）取代反应在稀酸中，叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇Cu2+则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏。在浓酸中，叶绿素中的Mg被H+取代，且生成的去镁叶绿素迅速分解出叶绿醇，并形成去镁叶绿酸，呈褐绿色。5）叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素的理化性质1）叶绿素a、b分别在665nm和649nm波长处（95%乙醇提取）有最大的吸收峰，同时在该波长处叶绿素a，b的比吸收系数K为已知，我们即可以根据Lambert-Beer定律，列出以下关系式：Ca=13.95A665–6.88A649Cb=24.96A649–7.32A665CT=Ca+Cb=18.08A649+6.63A665A665和A649为叶绿素溶液在波长665nm和649nm时的吸光度Ca、Cb、CT分别为叶绿素a、b及总的浓度，以mg·L-1为单位2）叶绿素a、b在652nm波长处有相同的比吸收系数（均为34.5），在此波长下测定叶绿素溶液的吸光度，也可计算出叶绿素a、b的总浓度。CT=（A652×1000）÷34.53）叶绿素的含量（mg/g）=[叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重2.4叶绿素含量的计算3.材料、仪器设备与试剂材料：菠菜叶片仪器：试管、容量瓶、研钵、分光光度计、水浴锅，等。试剂：石英砂、碳酸镁、95％乙醇、20%NaOH-甲醇、苯、36%乙酸、醋酸铜、浓盐酸1.叶绿体色素提取称取新鲜去大叶脉的菠菜叶片3g，剪碎放入研钵中，加少量石英砂和碳酸镁及5ml95％乙醇，研成均浆，过滤入25ml容量瓶，分别用5ml95％乙醇冲洗研钵3次，冲洗液同样过滤，收集滤液，倒入容量瓶中，最后用95％乙醇定容至25ml，放入暗处备用。2.叶绿素的荧光现象取叶绿素提取液2ml放入试管中，在直射光下观察溶液的透射光及反射光的颜色有何不同？（结果与分析1）3.光对叶绿体色素的破坏作用取两支试管，各加入叶绿体色素提取液2ml，一管放在直射光下，另一管放在黑暗处，1～2h后观察两管溶液颜色有何变化？（结果与分析2）4.实验步骤4.叶绿素的皂化作用3ml提取液+1ml20%NaOH-甲醇（摇匀）冷却+3ml苯（摇匀）+3ml蒸馏水（逐滴加，摇匀）静置，观察分层现象。下层是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的叶绿素a和b（以及少量的叶黄素）；上层是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。对照：另取3ml叶绿体色素提取液，加入2ml苯和2ml蒸馏水观察与皂化的叶绿素有何不同？（结果与分析3）60℃水浴3min5.H+和Cu2+对叶绿素分子中Mg2+的取代作用1）吸取叶绿体色素提取液2ml放入试管中，逐滴加入36%乙酸数滴，摇匀，观察溶液颜色的变化。（结果与分析4.1）2）当溶液变褐色后，倾出一半于另一试管中，投入几粒醋酸铜粉，水浴加热，观察溶液颜色变化，与未加醋酸铜（同时加热）的一管相比较。（结果与分析4.2）3）吸取叶绿体色素提取液2ml放入试管中，逐滴加入浓盐酸，观察颜色变化。（结果与分析4.3）6.叶绿体色素含量测定吸取叶绿体色素提取液5ml，用95%乙醇定容至50ml。以95%乙醇为空白对照，在波长665nm、649nm、652nm下测定吸光度，并分别计算叶绿素a和叶绿素b的浓度（Ca、Cb：mg/L），二者之和为总叶绿素的浓度。最后，根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量：叶绿素的含量（mg/g）=[叶绿素的浓度×稀释倍数×提取液体积]/样品鲜重比较两种方法所得的实验结果。（结果与分析5）5.结果与分析详见实验步骤（结果与分析1-6）6.注意事项1）为了避免叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进行，研磨时间应尽量短些，以不超过2分钟为宜。2）叶绿体色素提取液不能浑浊，否则应重新过滤。3）分光光度计的正确使用。1）用不含水的有机溶剂提取植物材料特别是干材料的叶绿体色素往往效果不佳，原因何在？2）研磨提取叶绿素时加入MgCO3，有什么作用？3）叶绿素a、叶绿素b在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸收峰波长进行叶绿素a、叶绿素b的定量分析？为什么？7.思考题加入少许碳酸钙的目的是为了防止在研磨过程中，叶绿素受到破坏。具体的情况是这样的：叶绿体中的色素所处的环境具微碱性，实验中，由于研磨会使细胞结构遭到破坏，细胞液（具微酸性）流出，酸性的细胞液就会直接接触叶绿体中色素，致使叶绿素的分子结构遭到破坏，使叶绿素失镁，呈黄褐色，所以加入少许碳酸钙是为了中和细胞液的酸性，可起到保护叶绿素的作用。