第十四章 基因工程

目录第十四章基因重组和基因工程GeneticRecombinationandGeneticEngineering目录第二节重组DNA技术又称DNA克隆或分子克隆DNARecombinationTechniqueisalsoCalledDNACloningorMolecularClone目录一、重组DNA技术相关概念克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。技术水平：分子克隆(molecularclone)即DNA克隆，基因克隆细胞克隆个体克隆（动物或植物）目录*DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。目录生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等目的①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程(geneticengineering)——实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。目录（二）工具酶限制性核酸内切酶DNA聚合酶Ⅰ逆转录酶T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶TaqDNA聚合酶目录重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ①合成双链cDNA分子或片段连接②缺口平移制作高比活探针③DNA序列分析④填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶①合成cDNA②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基目录*限制性核酸内切酶定义限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ目录作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。分类Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）目录特性I型II型III型限制和修饰活性单一多功能的酶分开的核酸内切酶和甲基化酶具有一种共同亚基的双功能的酶核酸内切限制酶的蛋白质结构3种不同的亚基单一的成份2种不同的亚基切割位点在距寄主特异性位点至少1000bp的地方可能随机地切割位于寄主特异性位点或其附近距寄主特异性位点3’端24~26bp处甲基化作用的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点识别未甲基化的序列进行核酸内切酶切割能能能序列特异的切割不是是是DNA克隆中的用处无用十分有用用处不大目录第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名HindⅢ属种株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶目录Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG目录BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口5’5’3’3’3’3’目录来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同功异源酶：目录有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAGGATCTA同尾酶目录（三）目的基因cDNA(complementaryDNA)基因组DNA(genomicDNA)目录（四）基因载体定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA目录克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。目录*载体的选择标准能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。在细胞内稳定性高，以便确保重组体稳定传代。目录*载体的分类:*质粒（plasmid）噬菌体（phage）病毒（virus）克隆载体（cloningvector）表达载体（expressionvector）常用的载体按来源分为载体按得到的产物分类可分为目录1.质粒(plasmid)特点能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。概念目录目录氨苄青霉素抗性基因四环素抗性基因多克隆位点目录•2.λ噬菌体（感染大肠杆菌病毒）λ噬菌体（lambdabacteriophage）DNA，为线性双链DNA，它的两端各有12个碱基的互补粘性末端，称COS位点。当噬菌体侵入宿主细胞，两个粘性末端互补结合，形成环状分子。λDNA在体外可包装成病毒颗粒，并高效感染大肠杆菌。目录噬菌体头部尾部尾丝目录裂解生长噬菌体感染细菌示意图◆裂解生长：环状DNA在细菌中多次复制，并合成大量噬菌体基因产物，然后装配成噬菌体颗粒，裂解宿主菌。◆溶源生长：λ噬菌体DNA整合到细胞染色体基因组DNA中，与染色体DNA一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解。目录λ噬菌体基因组中有较大区域仅与溶源生长有关，而对裂解生长并非绝对需要，因此可以被外源性DNA取代。外源性DNA目录限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文库目录目录M13噬菌体载体M13噬菌体基因组是单链环状DNA，当它侵犯宿主菌后，在细菌胞内酶的作用下，单链环状DNA转变成复制型双链环状DNA，可提取出来作为基因载体。目录质粒pUC19α互补：单独存在的α及ω片段都没有半乳糖苷酶的活性，只有宿主细胞与克隆载体同时表达两个片段时，宿主细胞内才有半乳糖苷酶活性，使特异性作用物（X-gal）变为蓝色化合物。突变型lac-E.coli表达β-半乳糖苷酶的ω片段。如果插入的外源基因是在lacZ’基因内，就会影响lacZ’的表达，利用lac-E.coli为转染或感染细胞，在含X-gal的培养基上生长时会出现白色菌落；若无外源基因插入，则出现蓝色菌落。多克隆位点编码β-半乳糖苷酶的α片段目录3.粘粒(柯斯质粒载体cosmidvector)目录酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他目录二、重组DNA技术基本原理目录以质粒为载体的DNA克隆过程目录目录（一）目的基因的获取1.化学合成法2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)（见第21章）目录*1.化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列目录组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌*从基因组DNA文库获取目的基因目录基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合目录2.基因组DNA文库（genomicDNA）◆存在于转化细菌内、由克隆载体所携带的所有基因组DNA片段的集合称为基因组DNA文库。基因组DNA基因片段重组DNA分子重组子目录mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库反转录酶载体受体菌复制*3.从cDNA文库获取目的基因逆转录酶AAAATTTTAAAASI核酸酶DNA聚合酶Ⅰ碱水解TTTT目录目录3.cDNA文库获取目的基因cDNA文库，cDNAlibrary逆转录mRNAcDNA目录cDNA文库的特点◆代表了取材当时所表达基因的总和，不包括那些未表达的基因。◆mRNA分子中不包括内含子及调控序列，所以cDNA文库的复杂性要比基因组文库低的多。目录基因克隆的基本步骤目录粘性末端质粒目的基因粘性末端匹配的粘性末端目录酶切后的目的基因片段接(连接)连接后的重组质粒DNA分子目录重组质粒目的基因大肠杆菌转(转化)染色体真好玩!目录筛(筛选)分解抗生素的酶含抗生素的培养基还活着!玩完啦!大肠杆菌大肠杆菌目录大量生长提取大量质粒酶切鉴定目录基因克隆的*主要步骤分:分离目的基因和载体DNA。切:用合适的酶切割上述两者，产生匹配的末端。接:连接酶连接目的基因和载体，形成重组DNA分子。转:重组DNA分子转入受体菌。筛:筛选具有抗药性的阳性克隆。目录*聚合酶链式反应PolymerasechainreactionPCR的产物数目以指数级方式增长DNA片段Cycle1Cycle2Cycle3CycleN理论上可达2n个拷贝原料（pg）产物(ug)483页目录KaryB.MullisUSA,forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method(1985年)1985年，美国PE-Cetus公司的人类遗传研究室Mullis等人才发明了具有划时代意义的聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR),使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿望成为现实。目录PCR的基本原理根据活体细胞DNA复制的机理及双链DNA在体外可随温度变化发生变性和复性的特点设计的。体外高效、快速、特异地扩增目的基因或DNA片段的技术.目录PCR反应体系与反应条件成分加量（ul）灭菌双蒸水X10×PCR缓冲液5.0MgCl22-8.0dNTPs1-2.0引物A1-2.0引物B1-2.0Taq酶0.25模板目录PCR反应条件变性95℃5min变性95℃1min退火55℃1min延伸72℃1min延伸72℃5min35cycles目录DNA模板变性与体内DNA解链过程不同，PCR中作为模板的双链DNA是通过95℃左右的高温使其发生变性，形成单链DNA目录模板与引物退火PCR通常需要两条寡核苷酸链作为DNA合成时的引物（primer）,通过控制退火条件，引物就能准确地与扩增区域的两端配对。primers3’3’引物目录引物延伸在PCR反应体系中的DNA聚合酶，能够催化反应体系中游离的单核苷酸（dNTPs）由引物5'→3'方向，按碱基配对的原则延伸，形成两条与模板DNA互补的复制链。Taq酶dNTPS新合成的链又可作为下轮循环反应的模板。目录热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，每一循环后的模板均比前一循环增加1倍。理论上讲，经n次循环后，扩增的DNA产物为2n拷贝。热变性-复性-延伸25-35次循环百万倍扩增目录尽管PCR扩增