正向遗传学技术

正向遗传学技术正向遗传学•传统的遗传学手段大致可以分为“正向遗传学”（forwardgenetics）和“反向遗传学”（reversegenetics）两类•两者之间正如字面上所说是相反的，正向遗传学是从表型变化研究基因变化，反向遗传学则是从基因变化研究表型变化。•正向遗传学是指，通过生物个体或细胞的基因组的自发突变或人工诱变，寻找相关的表型或性状改变，然后从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应的突变基因，并揭示其功能•简单的说，正向遗传学是从表型变化研究基因变化•优点：可以通过突变现象来揭示基因功能•缺点：在操作过程中需要进行诱变筛选，并且要有很多的实验个体才能具有可信度，故技术周期长；突变还存在有不定向性和低频性，故得到预想中的实验个体很难；同时得到突变基因也很难。正向遗传学技术流程•第一步；诱变筛选，包括两种一是大规模诱变筛选，二是插入诱变筛选。•在果蝇的大规模诱变筛选中，常染色体隐性突变筛选引入平衡染色体大大简化了该过程，平衡染色体有三个特点；一是含有大规模的染色体易位，具有正常功能但不会与相应染色体间进行同源重组，从而保证了突变的遗传稳定性。二是该染色体上含有一个显性标记基因，以便鉴别含有该染色体的个体。三是在纯合状态下是致死的。•用于进行化学诱变的果蝇品系相应染色体中带有一个隐性标记基因•其中平衡染色体上带有一显性标记基因只是没标出来，并纯合致死。它会抑制染色体间的重组。图中T是代表温度敏感致死基因，在29℃中培养胚胎会死。a代表隐性标记基因，＊代表新的突变基因•插入诱变筛选：利用转座子或病毒载体做诱变剂。•还是以果蝇为例，转座子p因子存在于某些果蝇类群中，它可以随机插入基因组中，并且可以在基因组中移动，完整的p因子包括转座所需的特殊序列和一个转座酶编码基因。在插入诱变中采用的p因子是缺陷型的，缺乏有功能的转座酶基因，这是为了避免p因子在突变体中随机移动以保证突变体的稳定。•p因子介导的诱变筛选是通过不同品系果蝇的杂交来实现的•具体步骤如下•一品系有缺陷型p因子，另一品系有转座酶杂交后F1代生殖细胞中，转座酶会诱导p因子在基因组中随机转座引起突变。F1与野生型杂交，F2就会含有杂合突变个体，同时p因子与转座酶基因分离，从而保证后代突变稳定性，之后近交获得纯合突变个体进行研究，这一方法的缺点在于p因子的插入位点并不是完全随机的，不具有普遍性。•第二步；突变基因的克隆。•得到所需的突变体后就需要对引起突变的目的基因进行克隆，同时还要确定所得的基因就是要找的目的基因，当它满足以下三点才可以确定；一是在该突变体中要检测到相应的基因突变，并且该突变足以引起改基因的失活或功能异常。二是改基因的野生型能够使突变体表型恢复。三是在野生型个体中，通过技术手段阻断该基因的功能，该个体应表现出与突变体一致的表型•基因的克隆有两种方式。•一是；对与p因子或病毒载体引起的插入突变。•这种克隆比较简单，可以用p因子序列作为探针，从该突变体的基因组文库中筛选出含有p因子的克隆，从而确定p因子插入位点和被阻断的基因，也可用pcr技术确定插入位点。•二是；对于化学诱变剂或射线照射引起的突变•这种就困难的多，多数情况下要采用定位克隆。它是根据目的基因在染色体上的位置进行基因分离，通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变基因的染色体位置，定位的精确程度是定位克隆成功的关键，它取决于已知染色体分子标记的精确程度并需要足够大的突变体类群。定位克隆•①以前是通过家系连锁分析资料或染色体微小缺失(杂合性丢失)等数据，确定基因在染色体上的位置；现在是分子标记检测手段（简单序列长度多态性SSLPs，限制片段长多多态性RFLPs，单核苷酸多态性SNPs)的分析，可以将突变基因定位到几百kb范围内，更加的精确。•②过去通过染色体步移(chromosomewalking)、染色体区带显微切割等技术，获得突变基因所在区段的DNA片段，现在随着许多模式生物基因组测序的完成，相应序列只需要进行数据库搜索就可以获得。这种方法非常的简单快捷。。•③首先通过生物信息学等手段确定该片段可能含有的基因，并根据这些基因的可能功能及该突变体的表型初步判断候选基因。•④从这些片段中进一步筛选目的基因，并作突变检测验证和功能分析正向遗传学技术的应用•在对斑马鱼造血系统进行研究时,其发育早期身体透明,有利于在体视镜下直接观察血液系统的发生发展：如血液的循环、心脏的跳动、血细胞的数量等；并且血细胞的谱系及调节血细胞的基因与哺乳动物高度保守；并且斑马鱼心血管系统早期发育与人类极为相似,而血液和心血管系统有缺陷的突变体仍然可以存活数天,为该领域研究提供了极为有利的条件。鉴于这些优点,斑马鱼成为了造血系统研究的最佳模式生物,尤其特别适宜于N—乙基—N—亚硝基脲(N-ethyl-N-nitrosourea,ENU它主要诱发单碱基突变,比较符合大多数的人类遗传性疾病的基因突变情况)化学诱变的大规模造血系统正向遗传学突变体的筛选，,目的是筛选造血系统发育缺陷的斑马鱼突变体,用于后续研究工作。