3细胞生物学的研究方法-PPT文档资料

第三章细胞生物学研究方法TechnologyforCellBiology学习目的与要求1.掌握细胞生物学基本研究方法的原理和应用。2.熟悉细胞生物学基本研究方法的技术特点。3.了解细胞生物学研究方法的进展。第三章细胞生物学研究方法TechnologyforCellBiology第一节第二节第三节中英文退出第四节第五节第六节第一节显微镜技术一、光学显微镜技术二、电子显微镜技术三、纳米显微技术四、超分辨光学显微技术退出首页TechnologyforCellBiology第三章细胞生物学研究方法(一)普通光学显微镜的分辨率1.分辨率（resolution，R）显微镜或人眼在25cm的明视距离处，能分辨被检物体微细结构最小间隔的能力。一、光学显微镜技术Cell,2010(143):1047-1058退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法(一)普通光学显微镜的分辨率一、光学显微镜技术不同显微结构的尺寸由左至右依次为动物细胞、细菌、线粒体、流感病毒、核糖体、绿色荧光蛋白、胸腺嘧啶。虚线为光学显微镜分辨极限。Cell,2010(143):1047-1058退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法2.分辨率公式n=聚光镜和物镜之间介质的折射率，空气为1，油为1.5。θ=标本对物镜镜口张角的半角，sinθ的最大值为1。λ=照明光源的波长，白光0.5m。横向分辨率Rx,y=0.61λ/n·sinθ纵向分辨率Rz=2λ/(n·sinθ)2退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法(一)普通光学显微镜的分辨率一、光学显微镜技术3.组织切片制备过程⑴固定（fixation）使大分子交联而保持在原有的位置上，防止结构移位或信息丢失。常用的固定剂：戊二醛、甲醛⑵包埋（embedding）使组织形成硬块，便于切片。常用的包埋剂：石蜡、树脂戊二醛甲醛退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法(一)普通光学显微镜的分辨率一、光学显微镜技术3.组织切片制备过程⑶切片（section）切片厚度为1～10m。⑷染色（staining）增大反差。退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法(一)普通光学显微镜的分辨率一、光学显微镜技术组织切片制备过程退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法宫颈鳞癌组织切片退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法(二)荧光显微镜可以呈现强反差的彩色图像1.荧光和荧光染料⑴荧光荧光分子可以在吸收特定波长的光后，发射出更长波长的可见光，称为荧光。前者称为激发光(excitationlight)，后者称为发射光(emissionlight)。⑵荧光染料由于荧光分子可以使被检样品呈现不同的染色，因此也称荧光染料。退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法一、光学显微镜技术常见荧光分子的激发光与发射光波长范围退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法荧光素(fluorescein)，绿色荧光四甲基罗丹明(tetramethyrhodanmine)，红色荧光退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法(二)荧光显微镜可以呈现强反差的彩色图像2.荧光显微镜工作原理荧光显微镜（fluorescencemicroscope）的结构特点：以高压汞灯和弧光作为光源。两组滤光片。荧光显微镜的光学系统退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法一、光学显微镜技术(二)荧光显微镜可以呈现强反差的彩色图像3.应用成像反差强，检测灵敏度高。定性、定位和定量的研究组织内的荧光标记物质。对活细胞内分子的动态变化进行实时观察。退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法一、光学显微镜技术(三)相差显微镜通常被用于观察活细胞波长变化振幅变化光速变化颜色变化明暗变化相位变化人眼能感知人眼不能感知原理：退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法一、光学显微镜技术相差显微镜（phasecontrastmicroscope）：利用光的衍射和干涉效应把透过标本不同区域的光波的光程差变成振幅差，使活细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比。(三)相差显微镜通常被用于观察活细胞应用：活细胞观察退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法一、光学显微镜技术相差显微镜观察培养中的HeLa细胞退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法相差显微镜下观察到的悬浮生长的昆虫草地夜蛾卵巢Sf9细胞退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法原理：散射光成像。应用：分辨率不高。适合观察活细胞内的细胞核、线粒体、液体介质中的细菌和真菌等。(四)暗视野显微镜通过散射光成像暗视野显微镜工作原理退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法一、光学显微镜技术(五)显微电影摄影技术记录细胞或细胞器的运动过程原理：用显微电影摄影术或电视录像以一定时间间隔拍摄。应用：准确记录细胞或细胞器的运动过程和速度。退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法一、光学显微镜技术(六)共聚焦激光扫描显微镜可以提供高清晰的彩色三维图像原理：单色激光作为光源。共聚焦：物镜和聚光镜互相共焦点，只有从标本焦面发出的光线聚焦成像，焦面以外的漫射光不参加成像。逐点扫描。退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法一、光学显微镜技术(六)共聚焦激光扫描显微镜可以提供高清晰的彩色三维图像应用：进行连续的光学切片，通过电脑进行三维重建。退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法一、光学显微镜技术共聚焦激光显微镜工作原理示意图退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法共聚焦激光显微镜下的血管内皮细胞微丝的分布退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法共聚焦激光显微镜获得被检物体三维结构的原理及呈现的三维图像退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法以电子束作光源，波长短，分辨率高。电子显微镜分辨率理论值：0.002nm实际值：0.1nm生物样品：2nm电镜下观察到的结构称为超微结构。二、电子显微镜技术退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法(一)透射电子显微镜（transmissionelectronmicroscope，TEM）光学显微镜与透射电子显微镜的比较退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法二、电子显微镜技术透射电子显微镜标本制备过程：⑴固定：双重固定——锇酸固定脂类，戊二醛固定蛋白。⑵脱水：含水标本干扰观察。⑶包埋：环氧树脂是常用包埋剂。(一)透射电子显微镜退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法二、电子显微镜技术透射电子显微镜标本制备过程⑷切片：电子的穿透力有限，需制作超薄切片，厚度通常为50~100nm。⑸染色：生物分子散射电子能力弱，需通过重金属染色，增大反差，常用锇、铀、铅等重金属的盐类。(一)透射电子显微镜退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法二、电子显微镜技术(二)扫描电子显微镜（scanningelectronmicroscope，SEM）原理：通过电子束照射在标本后产生的二次电子成像，二次电子产生的多少与电子束在标本表面的投射角有关。应用：可以直接观察标本表面的三维形态。《科学》ScientificAmerican中文版退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法二、电子显微镜技术(二)扫描电子显微镜《科学》ScientificAmerican中文版退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法二、电子显微镜技术扫描电镜的工作原理退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法扫描电镜观察的有丝分裂中期染色体形态（中国医科大学宋今丹提供）退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法凋亡细胞及凋亡小体透射电镜照片(左)和扫描电镜照片(右)，显示凋亡细胞的细胞核固缩，凋亡小体正从细胞脱落。（中国医科大学宋今丹提供）退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法(三)透射电子显微镜借助金属投影、冰冻断裂及冰冻蚀刻技术可获取三维图像1.金属投影法（metalshadowing）原理：以一定的倾斜角度向样品表面喷重金属，显示投影效果，给出样品表面三维结构。应用：观察蛋白、核酸类大分子，病毒颗粒及细胞壁退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法二、电子显微镜技术2.冰冻断裂（freeze-fracture）样品快速冷冻冰刀从脂双层疏水部分撬开暴露膜内部构造样品制备：应用：观察细胞膜性结构的内部构造。退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法二、电子显微镜技术2.冰冻断裂（freeze-fracture）退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法二、电子显微镜技术叶绿体内膜冰冻断裂复形，显示内膜上存在大量膜蛋白退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法3.冰冻蚀刻（freeze-etch）冷冻组织冰刀撬组织真空中升华暴露膜结构应用：观察细胞的内部构造。样品制备：退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法二、电子显微镜技术3.冰冻蚀刻（freeze-etch）退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法二、电子显微镜技术冰冻蚀刻显示昆虫肌肉细胞中的蛋白纤维退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法三、纳米显微技术纳米尺度：1nm～100nm生命是纳米尺度的分子活动，细胞是纳米组装机的集合体。扫描隧道显微镜和原子力显微镜的分辨率和可操控的颗粒在纳米水平，被称作纳米显微技术。退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法三、纳米显微技术退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法1.扫描隧道显微镜（scanningtunnelingmicroscope,STM）原理：使用原子尺度的探针在标本的表面进行扫描，在探针针尖和样品间施加一定电压，产生随标本表面形貌变化的隧道电流。特点：分辨率高，可在大气和液体等非真空状态下工作。应用：直接观察大分子的三维结构，如DNA双螺旋结构。退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法三、纳米显微技术1.扫描隧道显微镜（scanningtunnelingmicroscope,STM）扫描隧道显微镜下的人红细胞血影退出TechnologyforCellBiology首页第三章细胞生物学研究方法三、纳米显微技术2.原子力显微镜（atomicforcemicroscope，AFM）原理：通过分析探针针尖与样品之间的原子间作用力来获取所观察表面的微