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肠道菌群分析的临床意义及分析方法孙怡群微生态学•微生态学是二十一世纪新生命科学分支之一，这门新学科使医学从治疗医学和预防医学迈向保健医学的新阶段。•微生态学，促进了医学革命。正如一个国际学者所说：“没有任何生理指标，可以脱离与正常微生物群的关连”。近20年重大发现之一•人体内存在着一个微生态平衡与失调的动态关系。•医学任务就是如何认识平衡与失调的本质。•保持微生态平衡、矫正微生态失调，达到治病、防病和保健的目的。正常微生物群•人的消化、吸收、营养、免疫都离不开这些正常的生理性细菌，人体内的细菌99%都是好菌，不但不会致病，而且会引起人体产生免疫力。“坏菌”仅占少数。如果正常菌减少，“坏菌”增多，就会引起各种各样的疾病，这就是微生态失调。什么会使微生态失调呢？•抗生素的发现，给人类的生活带来了巨大的变化，许多危重病人从死亡线上被抢救回来。然而，随着抗生素的广泛使用，也给人类带来了新的问题，（除抗生素本身毒副作用外）就是普遍存在的抗生素引起的肠道菌群失调。•其他因素引起的如激素、同位素、放射线和免疫抑制剂的大量应用，也可造成导致菌群失调。抗生素应用抗生素应用•微生态失调的主要原因是抗生素的不合理应用。→•强调促菌的积极作用。促菌是促进正常有益菌、排斥、抑制、消灭有害菌，达到微生态平衡。•抗菌则是杀灭致病菌的同时也杀灭了有益菌，破坏了正常的微生态平衡。1.有益菌:或称共生菌，双歧菌、乳杆菌、优杆菌等2.中间菌：如肠球菌、大肠杆菌、拟杆菌有益，也有害3.有害菌：如绿脓杆菌、葡萄球菌、梭状芽孢杆菌一、粪涂片法的临床意义•肠道菌群的种类正常健康人的粪便其细菌总数约为1010个/g左右，按细菌种的分类可达几百种，但临床常见的主要菌种约数十种。正常健康人的粪便中占绝大多数是专性厌氧菌（简称厌氧菌）约占总数的99％，占少数的是兼性厌氧菌、专性需氧菌及微需氧菌。肠道菌群中的主要厌氧菌•有芽孢杆菌一个种G＋梭状芽孢杆菌属产气荚膜梭菌破伤风梭菌艰难梭菌肉毒梭菌无芽孢杆菌G＋双歧杆菌属分叉杆菌青春长婴儿双歧杆菌丙酸杆菌属痤疮丙酸杆菌优杆菌属迟缓优杆菌乳杆菌属嗜酸乳杆菌保加利亚乳杆菌放线菌属衣氏放线菌G-拟杆菌属脆弱拟杆菌多形拟杆菌梭杆菌属核梭杆菌坏死梭杆菌普氏菌属产黑色素普氏菌卟啉单胞菌属牙龈卟啉单胞菌粪涂片法的临床意义•正常微生物的平衡与失调要通过现代化技术检测才能确定，如对正常微生物群要进行定性、定量和定位检测，这些技术比较复杂。而此时一张大便涂片往往起到关键作用，有时竟可以挽救病人的生命！二、粪便直接涂片法的优缺点•设备简单，仅需一台显微镜、载玻片和革兰染液；•操作方法简单；•花费时间短（一般15min即可得出结果）•形象直观，直接了解粪便菌群的“像”，熟练者对菌群失调有较高的准确性。粪便直接涂片法的优缺点•检验者必须有一定的经验，否则易判断错误；•主要是定性检查，要求对菌群失调进行分度，初学者往往难以区分，致确定分度较困难。解决办法•按照图谱介绍方法，使操作标准化，以图谱的菌群图片作对照，指导判断；•多看正常人的和菌群失调病人的粪便涂片，经过一段时间就能掌握自如。•总之粪便涂片能快速诊断菌群失调，为早期治疗提供线索。三、显微镜油镜检查方法1.观察涂片和染色情况2.总览细菌总数可通过“比例概数法”进行判断（见表1）3.观察革兰阳性、阴性杆菌及球菌的比例改变（5级变化表2）计数方法是：选定有代表性的视野部分区域作细菌分类计数，缩小视野数200个以上的细菌以求得其比例。对于初学者或为求得标准值时可通过纸片分割视野的方法，五个小孔上下左右中直径0.2－0.3cm进行计数换算出百分率。这样比较客观。一般计数1000个细菌换算出百分率以求得各年龄组正常肠道菌群各类细菌的百分率。（评估见表3）胎便12h婴儿便母乳喂养1－2d后通常可行成一个典型的肠菌群，开始以革兰阴性球/杆菌多见2d婴儿大便3d婴儿大便5d婴儿大便5d婴儿大便，革兰阳性杆菌可见明显的分叉，革兰阴性杆菌有浓染（似拟杆菌，也开始有少量的革兰阴性球杆菌和革兰阳性球菌3个月幼儿正常粪便涂片6个半月母乳喂养幼儿正常粪便涂片健康青年之粪便涂片健康壮年之粪便涂片63岁正常女性粪便涂片71岁男性老年人粪便涂片76岁男性高血压脑病痴呆，卧床2年，营养良好，饮食规律（属无明显异常改变的老年肠道菌群像）四、菌群失调的分度标准•肠道菌群的数量与各种菌种的比例发生较大幅度的变化，超出正常范围并由此产生的一系列临床表现，称为：肠道菌群失调症。根据菌群失调的严重程度可分为三度。菌群失调的分度标准•Ⅰ度菌群失调：是一类较轻的失调，诱因去除后即可恢复正常，革兰阳性、阴性菌比例轻度变化。•Ⅱ度菌群失调：是一类中度的失调，呈现为慢性病程，菌群比例明显改变。Ⅰ度菌群失调Ⅰ度菌群失调Ⅰ度菌群失调Ⅱ度菌群失调Ⅱ度菌群失调Ⅱ度菌群失调Ⅱ度菌群失调•Ⅲ度菌群失调：是一类严重失调，又称为菌群交替症或二重感染。原有的肠道菌很少，而少见的细菌成为优势菌。菌群中各种细菌比例发生非常明显变化。•菌群失调的另一特殊表现形式，发生定位转移Ⅲ度菌群失调Ⅲ度菌群失调Ⅲ度菌群失调五、粪便直接涂片报告方式1粪便直接涂片报告方式1粪便直接涂片报告方式1粪便直接涂片报告方式1粪便直接涂片报告方式2粪便菌群定量分析菌落及菌体形态粪便菌群定量分析菌落及菌体形态粪便菌群定量分析菌落及菌体形态粪便菌群定量分析菌落及菌体形态粪便菌群定量分析菌落及菌体形态粪便菌群定量分析菌落及菌体形态