生物药剂学与药物动力学指导

-1-前言本教材是在长沙医学院药学系领导下，由药剂学教研室组织编写，作为全国高等学校教材《生物药剂学与药物动力学》的配套实验教材，充分结合了本系教与学的实际情况，供药学专业教学使用。实验课是生物药剂学与药物动力学课程中必不可少的重要的实践环节，通过实验，使课堂中讲授的重要理论和概念得到验证、巩固和充实，并适当地扩大知识面，加深学生对课堂教学内容的理解，掌握生物药剂学与药物动力学实验的设计及数据的处理方法，掌握实验方法在医药学相关领域的应用，掌握专业实验技能，培养学生独立思考和独立工作能力以及科学的工作态度和习惯。一、实验方式与基本要求1．由指导教师讲皆实验的基本原理、要求、实验目的，注意事项及主要设备的操作方法；2．实验小组人数为3～5人，由学生独立操作完成实验。3．学生完成规定的实验内容后，所记录的现象和数据、使用的仪器和负责的清洁工作，经指导教师检查，符合要求，方可离开实验室。4．教学实验除验证课堂理论外，并要求掌握相关实验仪器的工作原理和使用方法。二、实验报告1．实验报告应包括：实验目的、实验内容、实验原始记录、结果、结论、讨论等部分的内容；2．每个实验的实验报告应于实验结束后第三天，交实验指导老师处批改；3．实验结束时，实验报告中的原始记录应由指导教师检查并签字。三、考核与报告1．实验完成后，由学生将实验过程、原理、目的及实验结果整理成报告。2．指导教师对每个实验报告进行批改、评分。3．每次实验成绩的平均成绩记为实验考试成绩，不另外进行实验考试。实验成绩占总评成绩的20％。-2-实验一磺胺嘧啶在体小肠吸收实验一、实验目的1.掌握大鼠在体肠管泵循环法研究吸收的实验方法。2.掌握药物肠管吸收的机理和计算吸收速度常数(ka)、吸收半衰期(t1/2（a）)的方法。二、实验原理药物消化道吸收实验方法可分为体外法(invitro)、在体法(insitu)和体内法(invivo)等。在体法由于不切断血管和神经，药物透过上皮细胞后即被血液运走，能避免胃内容物排出及消化道固有运动等的生理影响，对溶解药物是一种较好的研究吸收的方法。但本法一般只限于溶解状态药物，并有可能将其他因素引起药物浓度的变化误作为吸收。消化道药物吸收的主要方式为被动扩散。药物服用后，胃肠液中高浓度的药物向细胞内透过，又以相似的方式扩散转运到血液中。这种形式的吸收不消耗能量，其透过速度与膜两侧的浓度差成正比，可用下式表示：hCCDkSdtdCPGI（1）式中dtdC为分子型药物的透过速度；D为药物在膜内的扩散系数；k为药物在膜／水溶液中的分配系数；S为药物扩散的表面积；CGI为消化道内药物浓度；Cp为血液中药物浓度；h为膜的厚度。令Dk＝P，则P为透过常数。一般药物进入循环系统后立即转运至全身各个部位，故药物在吸收部位循环液中的浓度相当低，与胃肠液中药物浓度相比，可忽略不计。若设'khPS，式(1)可简化为：CkdtdC'（2）式(2)说明药物透过速度属于表观一级速度过程。以消化液中药物量的变化率dX/dt表示透过速度，则：XkdtdXa（3）上式积分后两边取常用对数，变为：tkXXa303.2lglg0（4）-3-以小肠内剩余药量的对数lgX对取样时间t作图，可得一条直线，从直线的斜率可求得吸收速度常数ka，其吸收半衰期t1/2（a）为：aakt693.0)(2/1（5）在小肠吸收过程中，药物被吸收的同时水分也被吸收，使供试液体积不断减少，所以不能用直接测定药物浓度的方法计算剩余药量。由于酚红不能被小肠吸收，因此可向供试液中加入一定量的酚红，在间隔一定时间测药物浓度的同时，也测定的浓度，由酚红浓度先计算出不同时间供试液的体积，再根据测定药物的浓度，就可以求出不同时间小肠中剩余的药量或被吸收的药量。三、仪器与材料1．仪器恒流泵、紫外分光光度计、分析天平、恒温水浴、红外线灯、玻璃插管、移液管、锥形瓶、烧杯、注射器，眼科剪刀，眼科镊子，普通中号镊子，小剪刀，手术刀片等。2．材料0.1％NaNO2溶液、0.5％氨基磺酸铵(NH2SO3NH4)溶液、0.1％二盐酸萘基乙二胺溶液、1mol/L盐酸、0.2mol/LNaOH、生理盐水、Krebs—Ringer试剂(pH7.4)、1％戊巴比妥钠溶液等。3．动物大鼠，体重约200g，实验前禁食一夜（自由饮水）。四、实验内容1．供试液与酚红液的配制(1)供试液：精密称取磺胺嘧啶(SD)20mg、酚红20mg于1000m1容量瓶中，加Krebs-Ringer试剂定容，摇匀。(2)酚红液：精密称取酚红20mg于1000m1容量瓶中，加Krebs-Ringer试剂定容，摇匀。2．循环实验的操作(1)蠕动泵流速的调节：选择所需工作方向，按动快、慢档开关，调节流速为5m1/min和2.5m1／min。-4-(2)恒温水浴调节：将水浴温度调节为（37±0.5）℃。(3)供试液的准备：取80m1供试液加入循环装置的烧瓶中，见下图，将烧瓶置恒温水浴中预热至（37±0.5）℃。(4)生理盐水的准备：取生理盐水适量，预热至37℃备用。(5)大鼠麻醉：取实验前禁食一夜、体重约为200g的雄性大鼠一只，按40mg／kg体重腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，并固定于固定台上。(6)小肠两端插管：沿大鼠腹部中线打开腹腔(约3cm)，在十二指肠上部和回肠下部各切一小口，插入直径约0.3cm的玻璃管，并用线扎紧。(7)肠管洗涤：用注射器将37℃的生理盐水缓缓注入肠管，洗净肠管内容物。(8)做成回路：将肠管两端的玻璃管按图所示与胶管连接，做成回路，开动蠕动泵，其流速为5m1/min。(9)取样：以5ml/min流速循环10min后，将流速调节为2.5ml/min，立即自供试液烧瓶中取样两份(1ml和0.5m1各一份)，分别作为SD和酚红零时间样品，另向烧瓶中补加酚红液2ml，其后每隔15min按同法取样及补加酚红液，共取样9次，停止循环。3．含量测定(1)标准曲线的制作①SD的标准曲线：吸取供试液2、4、6、8、10m1分别置l0ml容量瓶中，加蒸馏水定容，再各精密吸取1ml置l0ml带塞试管中，加入lmol/L盐酸5ml，摇匀，加0.1％NaNO2溶液1m1，摇匀，放置3min，加0.5％氨基磺酸铵(NH2SO3NH4)溶液1m1,摇匀，放置3min，最后加1％二盐酸萘基乙二胺溶液2m1，摇匀，放置20min，照分光光度法在550nm的波长处测定吸收度。以吸收度对浓度回归，得到SD标准曲线方程。在体鼠小肠吸收泵循环实验装置1.供试液烧瓶2.蠕动泵3.大鼠-5-②酚红的标准曲线：精密称取酚红约25mg置250m1容量瓶中，加蒸馏水定容，分别精密吸取1、2、3、4、5、6m1置10m1容量瓶中，加蒸馏水定容，再分别吸取0.5m1置10m1带塞试管中，加0.2mol/LNaOH5m1，摇匀。照分光光度法在555nm波长处测定吸收度。以吸收度对浓度回归，得到酚红标准曲线方程。(2)样品测定①SD的测定：取样品lml置l0ml带塞试管中，加入lmol/L盐酸5m1，摇匀，以下步骤按SD标准曲线项下操作，在550nm的波长处测定吸收度。②酚红的测定：取样品0.5ml置10m1带塞试管中，加入0.2mol／LNaOH5m1，在555nm波长处测定吸收度。4．操作注意(1)在大鼠麻醉前应做好一切准备工作。如手术器械、水浴温度的调节，试药配制并放在近处，蠕动泵流速调节等。如果蠕动泵上并未标出流速，可用量筒接流出液（蒸馏水）的方式确定流速。(2)由于小肠很细，小肠两端插上玻璃管后再洗涤非常容易堵塞，防止的方法是先将十二指肠端插上玻璃管，回肠端找好后先用线扎紧(为以后找切口位置)，然后在扎线处切个小口。生理盐水(37℃)从十二指肠端插管处注入，洗涤内容物至净，再在回肠端切口处插上玻璃管。(3)插玻璃管时应注意方向，在十二指肠端向下插，回肠端向上插，以构成回路。(4)SD的测定中，加入氨基磺酸钠后要充分振摇至无气泡发生。(5)SD比色测定空白对照液的制法：取酚红液1ml至10ml带塞试管中，加1mol/L的HCl1m1，摇匀，以下操作按SD标准曲线制作。(6)酚红比色测定的空白对照液为0.2mol/LNaOH。五、实验结果1.分别写出SD和酚红的标准曲线回归方程和相关系数。2.SD和酚红样品浓度的计算根据SD和酚红的标准曲线方程，分别计算出SD和酚红样品的浓度，并填于下表中。-6-大鼠在体小肠吸收量的计算取样时间（h）SDASD浓度酚红A酚红浓度供试液体积剩余药量循环前A0C0A’0C’0V0=80mlP0=80C00A1C1A’1C’1'001'1CVVC111PCV0.25A2C2A’2C’2'112'2(1.5)40VCVC12225.1CVCP0.5A3C3A’3C’3'223'3(1.5)40VCVC333121.5()PCVCC………..….…….…tnAnCnA’nC’n'11'(1.5)40nnnnVCVC111.5nnnniiPCVC3.不同时间SD剩余量的计算按上表中公式计算出不同时间的剩余药量，并求剩余药量的对数值。4.ka和t1/2（a）的计算以剩余药量的对数对相应的时间作图，可得一条直线，由直线的斜率求出ka，并计算t1/2（a）。六、问题与讨论1.在体吸收试验方法的特点是什么?影响试验结果的主要因素有哪些？2.供试液中为什么要加酚红?-7-实验二磺胺类药物的组织分布实验一、实验目的1.了解磺胺类药物紫外分光光度法测定原理2.通过实验了解药物的体内分布二、实验原理药物在体内分布是指药物经吸收进入体循环后，通过血液和各组织的膜屏障转运至各组织的动态过程。药物分布决定于组织的血流量、药物对脂膜的扩散速度及药物与蛋白质的结合程度。药物要分布到药理作用靶部位才能发挥药效药物。但如果药物在某组织出现蓄积则可能产生毒性作用，所以一般药物的分布可以为药效学和安全性评价提供重要信息。通过组织分布研究，可以了解试验药物在实验动物体内的分布规律、主要蓄积器官或组织及蓄积程度等。组织分布实验通常通过给药后，于一定时间取出各组织或器官，经前处理后，用适宜的方法测定其中药物的含量。磺胺噻唑钠为对氨基苯类化合物，在酸性溶液中可使苯环上的氨基(－NH2)离子化生成铵类化合物(－NH3+)，进而与亚硝酸钠起重氮反应，产生重氮盐。此重氮盐可在酸性溶液中与显色剂胺类化合物(N-1-萘乙二胺)起偶联反应，形成紫红色的偶氮化合物。利用该呈色反应，采用分光光度法可测定出给药后不同时间不同组织中磺胺类药物的浓度。三、仪器与材料1．仪器离心机、紫外分光光度计、分析天平、匀浆器、移液管、锥形瓶、烧杯、注射器，眼科剪刀，眼科镊子，普通中号镊子，小剪刀，手术刀片等。2．材料10％磺胺噻唑钠注射液、0.05％二盐酸、N-1-萘乙二胺、0.5%氨磺酸铵溶液、0.5%亚硝酸钠溶液、20%三氯醋酸、生理盐水等。3．动物大鼠，体重约200g，实验前禁食一夜（自由饮水）。四、实验内容1.标准曲线的制作-8-取大鼠3只，断颈处死，收集血液至肝素化离心管中，并立即取出肝脏、肾脏及脑组织，用生理盐水冲洗干净后立即用滤纸吸干，精确称量组织重量，按1∶6加生理盐水（脑组织按1∶3）置玻璃匀浆器中进行研磨，研磨后将匀浆液倒入离心管中，3000r/min离心10min，取上清液1ml按1∶1加20%三氯醋酸沉淀蛋白，3000r/min离心10min，取上清液待用。血液经3000离心10min后取上层血浆待测。精密吸取沉淀蛋白后不同组织的上清液2ml（以2ml蒸馏水代替上清液，其他操作同样品处理，为空白对照）各6份于干净试管中，加入磺胺噻唑钠标准溶液使肝脏、肾脏组织液中药物浓度为0.1、0.25、0.5、1、5、10g/ml，脑组织液中药物浓度为0.05、0.1、0.25、0.5、1、5g/ml，再各加入0.5%亚硝酸钠溶液0.05ml，混合，静置3min后，各加入0.5%氨磺酸铵溶液1ml，摇匀2min后加显色剂（0.05％二盐酸N-1-萘乙二胺）2ml，摇匀