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实验三食品中金黄色葡萄球菌的检测检测方法：1、参照GB4789.10-2010金黄色葡萄球菌检测2、《食品微生物学实验原理与技术》实验三十食品中金黄色葡萄球菌检测实验目的：1、了解金黄色葡萄球菌检验原理；2、掌握金黄色葡萄球菌鉴定要点和检验方法金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属的一个种，可引起皮肤组织炎症，还能产生肠毒素，如果在食品中大量生长繁殖并产生毒素，可引起食物中毒，故食品中存在金黄色葡萄球菌对人的健康是一种潜在的危险，检查食品中金黄色葡萄球菌及数量具有实际意义。金黄色葡萄球菌性质及培养特征1、革兰氏阳性球菌，排列为葡萄状，无芽孢、无荚膜。金黄色葡萄球菌的扫描电镜照片经18～24小时培养后形成圆形隆起、边缘整齐、表面光滑、湿润、不透明的菌落，直径为1～2mm，不同菌株可产生不同色素，出现金黄色、白色、柠檬色。大肠杆菌在普通营养琼脂上的菌落特征：中等大小、圆形、表面光滑、无色半透明、边缘整齐2、在普通营养琼脂平板上的菌落特征：金黄色葡萄球菌在普通营养琼脂平板上的菌落3、具有高耐盐性，在7.5%氯化钠肉汤中呈现浑浊生长；4、在BP平板上菌落特征：圆形、光滑凸起，湿润，直径为2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围有一浑浊带，外层有一透明圈；5、在血平板上菌落特征：呈金黄色，有时也呈白色，大而凸起，圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈；BP培养基上的菌落血平板上的菌落6、血浆凝固酶试验致病性菌株可以产生血浆凝固酶，使血浆发生凝固。原理：鉴定食品中金黄色葡萄球菌：根据以上性质逐步确定。鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标：金黄色葡萄球菌能产生凝血浆酶，使血浆凝固；多数金黄色葡萄球菌致病菌株能产生溶血毒素，使血琼脂平板菌落周围出现溶血环，在试管中出现溶血反应。实验材料：1、样品：（1）含有大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的水样（2）鲜奶2、培养基与试剂：7.5%氯化钠肉汤、血琼脂平板、Baird-Parker氏培养基、无菌水、革兰氏染色剂3、器具及其他用品：显微镜、恒温培养箱、无菌吸管、无菌试管、无菌平皿、载玻片、涂布器、酒精灯、接种环等流程1、增菌培养法1.1检样处理：无菌操作取样25g（mL）加入225mL灭菌生理盐水，固体样品研磨或均质制成混悬液。1.2增菌及分离培养：吸取5mL上述混悬液，接种于7.5%氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤50mL培养基内，36℃±1℃培养24h，转种血平板和BP平板，36℃±1℃培养24h，挑取血平板上金黄色（有时为白色）菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶实验。1.3兔血浆凝固酶试验：吸取1：4新鲜兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物0.5mL，振荡摇匀，置36℃±1℃温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果，同时与已知阳性和阴性葡萄球菌菌株及肉汤作为对照。2.1梯度稀释转种BP平板吸取上述1：10混悬液，进行10倍第次稀释，根据样品污染情况，选择不同浓度的稀释液1mL，分别加入三块BP平板，每个平板接种量分别为0.3mL、0.3mL、0.4mL，然后用灭菌涂布器涂布整个平板，如水分多不易吸收，可将平板放在36℃±1℃1h，等水分蒸发后反转平皿置36℃±1℃培养。2、直接计数方法2.2转种血平板在三个平板上寻找周围有浑浊带的黑色菌落，并从中任选五个菌落，分别接种血平板，于36℃±1℃培养24h后进行染色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培养方法。2.3菌落计数将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数，除以5，再乘以稀释倍数，即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数。结果1.根据形态特征、血平板情况以及血浆凝固酶试验，判别检样中是否含有金黄色葡萄球菌。2.估算检样中金黄色葡萄球菌的含量。GB4789.10-2010第一法金黄色葡萄球菌定性检验GB4789.10-2010第二法金黄色葡萄球菌Baird-Parker平板计数GB4789.10-2010第三法金黄色葡萄球菌MPN计数三法特点及适用性：第一法适用于食品中金黄色葡萄球菌的定性检验第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。实验安排1、实验时间：2、分组：每3人一组3、评分标准：见附表1考核要素评分要素评分细则菌的鉴别10分菌落形态、色泽观察对菌的特征熟悉、识别正确（10分）对菌的特征较熟悉，基本能识别（10－分）不熟悉，识别不正确（5分以下）菌的分离10分接种操作5分操作规范、熟练、能分离出单个菌落4～5分基本规范、熟练，基本能分离出单个菌落2～4分不熟练，分离差（0～2分）分离效果5分效果好，有单个菌落（4～5分）能基本分离（2～4分）一般（0～2分）染色操作20分涂片操作10分熟练、染色效果明显（9～10分）较熟练，染色效果尚好（6～8分）染色效果较差（5分以下）显微镜的使用10分正确、熟练、视野清晰（9～10分）基本正确，较熟练（6～8分）