实验 聚丙烯酰胺

11级医学检验四小组实验目的掌握盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理熟悉盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术实验原理以聚丙烯酰胺凝胶做支持物的电泳技术是聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。聚丙烯酰胺凝胶是单体聚丙烯酰胺（Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)交联而成的，催化剂为过硫酸铵(AP)，加速剂为四甲基乙二胺TEMED,形成三维网状凝胶。聚丙烯酰胺凝胶（PAG）的聚合反应：由单体聚丙烯酰胺(Acr)和甲叉双丙烯酰胺(Bis)交联而成的三维网状结构凝胶。Bis：交联剂过硫酸铵(AP)：引发剂，提供自由基，引发聚合反应四甲基乙二胺(TEMED)：催化剂,加快引发释放自由基的速度三大效应聚丙烯酰胺凝胶电泳采用不连续系统（即缓冲液成分、pH及凝胶孔径不连续）聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过浓缩效应、分子筛效应、电荷效应，将血清中各蛋白质成份依其分子大小、电荷多少不同而进行高效分离。1.浓缩效应分离机制：凝胶层孔径不连续：浓缩胶大孔径，分离胶小孔径缓冲液离子不连续：电泳液中Gly-(慢离子)；凝胶中Cl-(快离子)；Pr-介于二者之间pH值不连续：电泳缓冲液pH=8.3；浓缩胶pH=6.7；分离胶pH=8.9电位梯度不连续•缓冲液离子成分、PH的不连续性：电极缓冲液通常为pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液，样品及凝胶中缓冲液为pH6.7Tris-HCL缓冲液。电极缓冲液的pH=8.3，甘氨酸的电离小，有效迁移率小，称为慢离子；浓缩胶中的氯离子完全电离，有效迁移率大，称为快离子；蛋白质在浓缩胶中介于二者之间。•电位梯度的不连续性：电泳开始后，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度（电位与电导率成反比），使甘氨酸离子追赶氯离子，蛋白质夹在中间而被压缩。1cm厚样品层可以压缩0.25μm的厚度。成分pH值孔径电泳缓冲液甘氨酸(慢离子)8.3样品蛋白质6.7浓缩胶Cl-(快离子)6.7大分离胶Cl-(快离子)8.9小有效迁移率=迁移率解离度2.分子筛效应分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。当样品进入分离胶，凝胶孔径变小，分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。3.电荷效应电荷量不同，迁移率不同。实验仪器电泳装置稳压电源盘状电泳槽毛细滴管刻度吸量管玻璃管和橡胶帽微量移液器注射器和长针头脱色摇床试剂Acr和Bis：棕色瓶保存TEMED-四甲基乙二胺，避光保存。过硫酸铵(新鲜配制)染色液：0.1％溴酚兰液洗脱液：7％醋酸其他试剂：见下表贮存液的配制。贮存液100ml溶液中的含量pH工作溶液配制的体积比11NHCl48.Oml；Tris36.6克TEMED0.23ml8.9分离胶制备：1份1号，2份2号，1份水；抽气后加入4份3号；凝胶浓度7％；pH=8.92Acr28.0克；Bis0.725克3过硫酸铵0.14克41NHCl48.Oml；Tris5.98克TEMED0.46ml6.7浓缩胶制备：1份4号，2份5号；抽气后加入4份6号；凝胶浓度2.5％；pH=6.75Acr10.0克；Bis2.5克6蔗糖40.0克7电泳槽缓冲液：Tris0.60克甘氨酸2.88克8.3用时可稀释10倍500ml可供12根电泳管1准备每人取电泳管1支，并在距电泳管下端7cm和7.5cm处画横线做标记，加1-2滴40％蔗糖于橡胶帽内堵住电泳管底部，塞紧。实验步骤试剂分离胶溶液（ml）浓缩胶溶液（ml）分离胶缓冲溶液（pH8.9）1.25—浓缩胶缓冲溶液（pH6.7）—1.25单体交联剂2.51.0DDW6.197.65催化剂（10%AP）0.100.10TEMED0.020.02成胶时间30min15min浓度7.5%(孔小)3%（孔大）2制胶(取小烧杯2个,按表加液)按上述操作混匀分离胶溶液，缓慢注入玻璃管7cm处，滴加一滴蒸馏水，然后在室温下聚合，聚合20-30min；待分离胶成胶后，用滤纸条吸干上层水分，灌浓缩胶至7.5cm处，再滴加蒸馏水一滴，静置15min左右。浓缩胶凝胶后，吸取上层水，拔掉橡胶帽吸去下层蔗糖溶液。将电泳管套在橡皮塞中，装入电泳槽，然后加入下槽缓冲液，排净管底空气使用。3灌柱4样品液制备：血清:0.1ml40%蔗糖:0.1ml0.05%溴酚兰:0.1ml添加于一个小试管中混匀备用5装电泳管和上样将凝胶管插入电泳槽槽底橡胶塞孔中，加入电极缓冲液与下电泳槽，随后放入凝胶管及上槽，除气泡,然后在上层添加缓冲溶液覆盖凝胶管上端，除气泡。加样品液10μl至浓缩胶面。6电泳上槽——负极（黑）下槽——正极（红）电流：先浓缩胶:1.5mA/管然后分离胶:3.0mA/管7剥胶电泳完成后取下玻管，用一长针头注射器吸满蒸馏水为润滑剂，将针头插入玻管内壁和凝胶柱表面之间，缓缓旋转玻管，一边注水一边使针头呈螺旋式推进。最后可用洗耳球在玻管浓缩胶端轻加压力，就可将凝胶柱压出玻管。8固定和染色：先用固定液固定5分钟，再在培养皿中装0.用洗脱液漂洗脱色。1%溴酚蓝碱性染液染色10mim（染液回收）。9脱色加洗脱液（7%冰醋酸）摇床脱色，三次，每次2~3min，一周之后观察结果。实验结果+—1．丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触。2．制胶时，要充分摇匀，加速剂TEMED最后加。3．注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。4.氨基黑染色﹑脱色﹑染液回收。5．固体胶切忌倒入水池。6.注意观察实验现象：分界面，浓缩效应7.水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡。8.凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。9.剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。注意事项：方法学评价PAGE优点：分辨率高，具有三大效应，灵敏度高可达10^-6g可以通过控制单体和交联剂的浓度来调节凝胶孔径的大小使大分子得到更好地分离。聚丙烯酰胺凝胶只带有不活泼的酰胺基侧链，所以凝胶性能稳定，电渗作用小，无吸附，化学惰性强，与生物大分子不发生反应。电泳过程中不受温度、PH的变化影响。在一定浓度范围内，凝胶透明，有弹性，机械性能好，易于观察。单体纯度高，在相同的实验条件下，电泳结果有很好的重复性。凝胶杂质少，在很多溶剂中不溶，可适用于少量样品的制备，不致污染样品。缺点：但它的操作较复杂,影响实验效果的因素较多,使其在生化实验教学中的开展受到一定限制。醋酸纤维薄膜电泳优点：样品用量少、灵敏度高区带清晰，分离效果好易于定量，便于保存。对各种蛋白质几乎完全不吸附，无拖尾现象。对染料也没有吸附，电渗作用小。应用面广。缺点：分辨率较聚丙烯酰胺凝胶电泳要低SDS-PAGE优点与PAGE相似，SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。缺点：电荷异常或构象异常的蛋白、带有较大辅基的蛋白（如糖蛋白）及一些结构蛋白等测出的Mr不太可靠。